刺梨汁对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

目的 :探讨刺梨汁的抗动脉粥样硬化机制。 方法 :在刺梨汁参与下 ,氧化的极低密度脂蛋白 (Ox- VL DL)与小鼠腹腔巨噬细胞孵育一段时间 ,通过测定细胞胆固醇含量和观察细胞形态改变 ,分析刺梨汁对 Ox- VL DL 促泡沫细胞形成的影响。 结果 :较低浓度的刺梨汁能明显抑制 Ox- VL DL 对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇酯的堆积 (P<0 .0 0 1) ,并呈浓度依赖性。刺梨汁浓度为 2 μl/m l和 4μl/ml时 ,Ox- VL DL 堆积的细胞胆固醇酯含量分别被抑制了 5 9.8%和 90 .1%。形态学观察显示 ,经刺梨汁处理的巨噬细胞猩红阳性染色显著减少。 结论 :刺梨汁通过抑制Ox- VL DL 的促泡沫细胞形成来实现其抗动脉硬化的功能。

巨噬细胞源性泡沫细胞适配子PM1的特异性

目的研究特异性寡核苷酸适配子PM1与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变结合的特异性,为动脉粥样硬化的体内靶向治疗提供实验依据。方法对适配子PM1进行FITC标记,荧光显微镜分别观察适配子与血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、巨噬细胞源性泡沫细胞结合情况。采用高脂方法建立兔动脉粥样硬化模型,利用PCR方法和荧光显微镜观察适配子与动脉粥样硬化病变结合情况。结果适配子PM1与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变组织高度特异性结合,但不结合血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞和正常动脉组织。结论筛选出的适配子PM1能特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变。

肥大细胞改变THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇含量及抑制胆固醇流出

目的:以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,探讨肥大细胞(MC)对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量、分配和流出的影响及机制。方法:THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞在MC颗粒释放物存在或缺乏下与高密度脂蛋白3(HDL3)共育。高效液相色谱检测泡沫细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和酯化胆固醇(EC)含量,用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,运用逆转录聚合酶链反应检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的mRNA水平,采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测HDL3及apoA-Ⅰ的降解。结果:MC组泡沫细胞内TC、FC明显高于对照组(TC对照组为527.3 mg/g,MC组为917.9 mg/g);EC/TC比值低于对照组(7.6%vs47.5%);细胞内胆固醇流出少于对照组(26.92%±2.6%vs40.98%±3.4%,P<0.05);而泡沫细胞ABCA1的mRNA水平与对照组无明显差异。MC颗粒释放物处理HDL3后,聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,约有28%的apoA-Ⅰ被降解,在分子量26 kD左右处出现了新的条带,产生了1个26 kD的小多肽。结论:肥大细胞可通过降解HDL3及apoA-Ⅰ抑制细胞内胆固醇流出而增加细胞内胆固醇蓄积,这个作用与ABCA1表达无直接关系。

小鼠巨噬细胞源性趋化因子作为佐剂增强不可分型流感嗜血杆菌P6蛋白疫苗的免疫保护作用

目的用原核细胞表达不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)P6蛋白并观察巨噬细胞源性趋化因子(MDC)对NTHi-P6蛋白疫苗免疫效果的影响。方法构建原核表达质粒PGEX-6P2/P6,转化E.coli XL1-Blue,诱导P6蛋白的表达。将BALB/c小鼠随机分为P6蛋白联合Freund佐剂与MDC组、P6蛋白联合Freund佐剂组、PBS对照组。分别于0、14、28 d经腹腔免疫,末次免疫后14 d,每组取12只小鼠取血,ELISA检测血清中IgG抗体水平。每组取3只小鼠,制备脾淋巴细胞,ELISA检测IL-4和IFN-γ水平。用10×LD50NTHi攻击每组剩余15只小鼠,观察免疫保护作用。结果 P6蛋白联合Freund佐剂与MDC组、P6蛋白联合Freund佐剂组均能诱导小鼠产生IgG抗体,其滴度分别为1∶1 140.25、1∶3 044.38,P6蛋白联合Freund佐剂与MDC组小鼠抗体滴度和IFN-γ水平明显高于P6蛋白联合Freund佐剂组(P<0.05),但IL-4水平2组间差异无统计学意义(P>0.05)。经NTHi攻击后,P6蛋白联合Freund佐剂与MDC组小鼠的生存率达80%,与PBS组相比差异有统计学意义(P<0.05),但与P6蛋白联合Freund佐剂组相比无显著性差异。结论 MDC作为蛋白佐剂,在一定程度上增强了NTHi-P6蛋白疫苗的免疫保护作用。

巨噬细胞源性神经营养因子的纯化和鉴定

应用Sephacryl S-100-HR凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)和反相高效液相色谱(R-HPLC)分析,从巨噬细胞条件培养基中纯化了巨噬细胞源性神经营养因子(MΦDNF)。该因子在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条单一蛋白带,其分子量为60.5kD,等电点约5.1。其氨基酸组成含有较高比例的天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和赖氨酸。纯化的MΦDNF能支持体外培养的小脑皮质神经元的存活,增强其活性及促进神经元突起的生长。其最大效应浓度为500—1000ng/ml。

仙人掌多糖对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇蓄积及其相关基因表达的影响

采用PMA和ox–LDL构建THP–1巨噬细胞源性泡沫细胞模型,观察不同浓度(5、10、15 nmol/L)仙人掌多糖(ODP–Ia)对泡沫细胞内脂质、胆固醇蓄积以及介导胆固醇流出的ABCA1、ABCG1、SR–BI基因表达的影响。结果显示:THP–1巨噬细胞泡沫化后胞内蓄积了大量脂质,高剂量(15 nmol/L)ODP–Ia能够显著减少胞内脂质、胆固醇蓄积,并增强ABCA1、ABCG1、SR–BI m RNA及蛋白表达(与单独ox–LDL处理组比较,P<0.05),但效果均次于阳性对照依折麦布组(P<0.05),低、中剂量(5、10 nmol/L)ODP–Ia作用效果均不显著。本研究结果表明,ODP–Ia可通过增强ABCA1、ABCG1、SR–BI基因表达来减少胞内胆固醇蓄积。

护心方对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出及ABCA1表达的影响

目的观察护心方对THP-1细胞源性泡沫细胞Apo AI介导的胆固醇流出及ABCA1表达的影响。方法 THP-1细胞诱导分化成巨噬细胞后,在ox-LDL刺激48 h,使巨噬细胞转化为泡沫细胞,以护心方含药血清作用24 h。采用液体闪烁计数法观察细胞内胆固醇的流出,Western blot检测细胞ABCA1的蛋白表达水平,q PCR检测细胞ABCA1的mRNA表达水平。结果护心方含药血清可增加泡沫细胞胆固醇的流出且呈时间依赖性(P<0.05),同时能上调诱导后的泡沫细胞ABCA1蛋白水平(P<0.05),但对ABCA1 mRNA的表达水平无影响。结论护心方可通过提高泡沫细胞ABCA1蛋白表达水平,增加细胞内Apo AI介导的胆固醇流出,是其临床治疗动脉粥样硬化的机制之一。

脂联素对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1及胆固醇含量的影响及机制

目的探讨脂联素对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1及胆固醇含量的影响及其可能的机制。方法体外培养RAW264.7细胞,加入20 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共同孵育48 h,将其诱导成泡沫细胞,加入不同浓度(0、1、5、10μg/mL)的脂联素干预24 h,RT-PCR测定ABCA1 mRNA的表达,高效液相色谱测定细胞内胆固醇含量。观察脂联素对泡沫细胞中ABCA1表达的影响。结果脂联素显著增加RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 mRNA的表达(P<0.05),并增加细胞内胆固醇含量,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论脂联素可以增加巨噬源性泡沫细胞ABCA1转录水平,促进胆固醇流出,延缓AS的发生发展。

通脉降脂口服液抑制巨噬细胞源性生长因子对平滑肌细胞c-myc基因表达的实验研究

采用原位杂交技术,进一步探讨通脉降脂口服液对血管平滑肌细胞(SMC)增生相关基因 c-myc mRNA 表达的影响。观察到巨噬细胞源性生长因子可明显促进 SMC c-mycmRNA 高表达;而通脉降脂口服液能阻止 MDGF 刺激 SMC 的作用,使 c-myc mRNA 表达水平明显下降。提示通脉降脂口服液阻止动脉粥样硬化(AS)形成的机理,可能是通过抑制 SMC c-myc mRNA 的表达,从而抑制 SMC 增殖,阻止 AS 形成。

Cell SELEX技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子的初步研究

目的利用Cell SELEX技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子。方法通过80mg/L氧化性低密度脂蛋白诱导THP-1巨噬细胞为泡沫细胞;聚合酶链反应扩增文库;生物素-链霉亲和素磁珠分离法构建单链DNA文库;以巨噬细胞源性泡沫细胞为靶细胞,巨噬细胞和血管平滑肌细胞为反筛细胞,利用Cell SELEX技术筛选与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的寡核苷酸序列,并对最后一轮筛选结果进行克隆测序。结果 PCR的退火温度对PCR产物的量有显著的影响,退火温度由65℃提高为72℃时的产物量明显增加。利用生物素-链霉亲和素磁珠分离法获得了纯度高、产量大的ssDNA文库;经过18轮筛选后,成功获得了28个与预期大小相同的ssDNA序列。结论利用Cell SELEX技术筛选出了巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子,为研发用于动脉粥样硬化的早期无创诊断试剂和靶向治疗药物奠定了基础。

同型半胱氨酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的形成及细胞内胆固醇流出的影响。方法首先以160 nmol·L-1的佛波酯(PMA)刺激THP-1单核细胞48 h使其分化为巨噬细胞,继之用含0、50、100、200μmol·L-1的Hcy和100 mg·L-1的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育24 h,使其转化为泡沫细胞。采用油红O染色进行泡沫细胞定性分析,泡沫细胞面积计数法进行半定量分析,总胆固醇和游离胆固醇测定法进行定量分析。结果经PMA处理48 h后,呈簇集状悬浮状态的单核细胞分化为形态不规则、有伪足并贴壁的巨噬细胞,继之经Hcy和ox-LDL处理后的细胞中出现了大量红染的脂滴,细胞呈现泡沫化改变;细胞面积计数法显示实验组较对照组而言泡沫细胞阳性率升高(P<0.05),以100μmol·L-1Hcy组最明显(P<0.05);酶终点法测定胆固醇流出结果显示,实验组的胆固醇酯相对值明显高于对照组(P<0.05)。结论成功建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型,Hcy减少了细胞内胆固醇的流出,在动脉粥样硬化的发生发展中扮演重要作用。

丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞蛋白质组的影响

目的应用双向电泳和质谱技术研究丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞蛋白质组的影响,探讨丹参酮ⅡA调脂和抗动脉粥样硬化作用的分子机制。方法分离纯化获得人血清低密度脂蛋白(LDL),用CuSO_4进行氧化得到ox-LDL,与RAW264.7细胞共孵育,形成的泡沫细胞用含20 mg/L丹参酮ⅡA继续培养24 h作为丹参酮组,不含丹参酮ⅡA的溶液培养24 h作为对照组,经超声破碎细胞,离心,取上清进行蛋白质定量,丹参酮ⅡA组和对照组蛋白质等量上样,进行双向电泳,电泳完毕后用硝酸银染色得到不同样品的蛋白质组图谱。经Labscan软件进行差异蛋白质组分析,选取蛋白质表达量差异超过2倍的蛋白质作为差异蛋白。经胶内酶解及质谱分析,得到肽质量指纹图谱,通过Mascot数据库搜索,结合2-D图谱上蛋白质的分子量、等电点信息鉴定蛋白质。结果丹参酮组钙网蛋白、波形蛋白、过氧化物酶2、CuZn-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、亮氨酸拉链蛋白、stabilin-1、造血细胞系特异性蛋白表达量增加,而GTP蛋白、ATP合酶、mimitin、IL-5、热休克蛋白70(HSP70)、翻译控制肿瘤蛋白、氯离子通道蛋白1表达量降低。结论丹参酮ⅡA通过降低GTP蛋白和HSP70表达以及提高钙网蛋白表达改善泡沫细胞对脂代谢的调控功能;通过提高stabilin-1表达和降低ATP合酶表达调节细胞的吞噬能力;通过提高亮氨酸拉链蛋白和波形蛋白表达促进脂与脂蛋白的代谢;通过提高过氧化物酶2和CuZn-SOD表达起到清除氧自由基和抗脂质过氧化作用;通过降低mimitin和IL-5表达以及提高造血细胞系特异性蛋白表达而具有抗炎和抗细胞凋亡作用;通过降低氯离子通道蛋白1和翻译控制肿瘤蛋白表达具有抗肿瘤作用。因此可以认为丹参酮ⅡA可能具有调节血脂和抗动脉粥样硬化作用,在临床上可以用于心脑血管疾病的治疗。

NgBR对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响

目的通过转染小干扰RNA(siRNA)沉默RAW264.7细胞源性泡沫细胞神经轴突生长抑制因子B受体(Ng BR)表达,研究Ng BR对泡沫细胞胆固醇逆转运(RCT)的影响,探索从RCT途径抗动脉粥样硬化(As)的新方法,为冠心病的临床防治提供新思路。方法利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导RAW264.7细胞形成泡沫细胞,油红O染色进行鉴定。将泡沫细胞分为四组:空白对照组、siRNA阴性对照组、Ng BR-siRNA1转染组(si Ng BR-1组)、Ng BR-siRNA2转染组(si Ng BR-2组)。利用siRNA沉默泡沫细胞Ng BR基因表达,并利用real-time PCR和Western blot对其进行干扰效率鉴定。随后采用real-time PCR检测各组细胞肝X受体α(LXRα)、三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)及三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)mRNA表达,Western blot检测各组细胞相应蛋白含量,液闪计数仪检测胆固醇流出率。结果 ox-LDL成功诱导泡沫细胞形成;si Ng BR-1组和si Ng BR-2组Ng BR mRNA及其蛋白明显下调(P<0.05);si Ng BR-1组和si Ng BR-2组LXRα、ABCA1和ABCG1的mRNA及其蛋白表达显著降低(P<0.05),胆固醇流出显著减少(P<0.05)。结论 Ng BR可以增加巨噬细胞源性泡沫细胞RCT的调控基因LXRα及其下游基因ABCA1、ABCG1的表达,从而减弱或者避免As的发生和发展,为冠心病的临床防治提供理论依据。

巨噬细胞源性神经营养因子的初步分离

本文制备了巨噬细胞条件培养基（ＭφＣＭ），并应用快速自动比色微量分析法检测ＭφＣＭ对体外培养的生后７ｄＳＤ大鼠小脑皮质神经元的作用。结果表明，分子量大于１０ｋＤ的ＭφＣＭ对神经元（细胞密度１×１０６／ｍｌ）的作用，与对照组比较有明显的神经营养活性（Ｆ＜０．０５）；用盖玻片培养法表明，该组份有促进神经元突起生长的作用。ＭφＣＭ经ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１００－ＨＲ凝胶层析和生物活性鉴定，获得了具有神经营养活性的第二峰洗脱液。此洗脱液经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，证明ＭφＣＭ中神经营养活性成份的蛋白质其分子量为３１ｋＤ－６８ｋＤ之间。

柿叶总黄酮抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的作用研究

目的探讨柿叶总黄酮对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇脂质蓄积的影响及其潜在机制。方法体外培养THP-1细胞,160nmol/L佛波酯诱导分化为巨噬细胞,与50μg/mL ox-LDL孵育建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型,分别用不同浓度的柿叶总黄酮(0、0.5、1、2、4μg/mL)处理。油红O染色检测细胞内脂质蓄积情况,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,qPCR和Western blot分别检测SR-A和ABCA1 mRNA和蛋白表达情况。结果柿叶总黄酮能显著性抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积,减少细胞内游离胆固醇(FC)、总胆固醇(TC)和胆固醇酯(CE)含量,降低相关蛋白SR-A的摄取以及促进胆固醇外排关键蛋白ABCA1表达。结论柿叶总黄酮通过降低相关蛋白SR-A的摄取以及促进胆固醇外排关键蛋白ABCA1表达,减少细胞内胆固醇含量,抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积。

巨噬细胞源性生长因子所致兔眼神经胶质细胞的迁移

以兔腹腔巨噬细胞条件培养基作为趋化因子的来源，用微孔滤膜法检测其对培养的兔视网膜神经胶质细胞的趋化活性。结果表明。该条件培养基对培养的神经胶质细胞具有趋化活性。从而说明单核巨噬细胞系统在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）发病中的作用。

Ibrolipim对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体Al表达及肿瘤坏死因子-α释放的影响

目的为探讨巨噬细胞源性泡沫细胞肿瘤坏死因子-α的释放与新药Ibrolipim(NO-1886)抗动脉粥样硬化作用的关系。方法采用体外培养的THP-1细胞构建泡沫细胞模型,分别经Ibrolipim处理6、12、24 h后,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量的变化,双抗体夹心法检测细胞培养液肿瘤坏死因子-α的水平,免疫印迹法检测细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A l蛋白的表达。结果与对照组比较,泡沫细胞经Ibrolipim处理6、12、24 h后,细胞内总胆固醇含量和游离胆固醇含量不断减少,细胞培养液中的肿瘤坏死因子-α水平逐渐降低,细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A l蛋白的表达升高。结论Ibrolipim抗动脉粥样硬化的作用与其减少泡沫细胞肿瘤坏死因子-α的释放有关。

巨噬细胞源性生长因子对培养的动脉平滑肌细胞细胞周期进程的影响

以兔腹腔巨噬细胞条件培养基作为生长因子的来源，用流式细胞计及显微分光光度计测定细胞群体内单个平滑肌细胞内DNA含量，结合相差显微镜观察，研究其对培养的平滑肌细胞细胞周期进程的影响。结果表明，用贫血小板血清培养基使平滑肌细胞生长受抑制时，细胞周期进程既受阻于G0／G1期，亦受阻于G2期；条件培养基可促进平滑肌细胞从G0／G1期进入S期和由G2期进入M期。