Tim-3信号通路调控巨噬细胞极化在鲍曼不动杆菌性肺炎免疫致病和免疫防治中的作用

目的探讨T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(T-cell Ig-mucin-3,Tim-3)信号通路调控巨噬细胞极化在鲍曼不动杆菌性肺炎免疫致病和免疫防治中的作用。方法选取正常小鼠,定为正常组20只,将小鼠感染为鲍曼不动杆菌毒性临床菌株和疫苗菌株,检查生存率,细菌定量,组织病理等,用Real-time PCR检测细胞因子,用流式检测BALF炎症细胞浸润,分别建立小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型组20只和鲍曼不动杆菌疫苗接种模型组20只。通过ELISA法、Western blot技术检测Tim-3信号通路抑制巨噬细胞极化方向的影响。结果与正常组相比,临床株组IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β显著升高(P<0.05),与临床株组相比疫苗组IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β显著降低(P<0.05),差异有统计学意义。正常组肺组织结构正常,无明显病变;临床株组肺组织肺泡结构受损严重,可见血管充血、炎性细胞浸润等现象;与临床株组相比,疫苗组肺组织结构损坏得到缓解。临床株组与正常组比较鲍曼不动杆菌性肺炎性老鼠肺组织巨噬细胞的MI标记基因TNF-a的表达有所减少,但CD32的表达有所增加。M2标记基因CD206和IL-10的表达增加(p)(P<0.05);Tim-3通路抑制巨噬细胞后CD32、TNF-α基因的相对表达量升高,CD206表达升高,IL-10表达降低(P<0.05)。结论Tim-3信号通路调控巨噬细胞极化方向,在鲍曼不动杆菌性肺炎致病中起到免疫防治作用。

血清tau蛋白和巨噬细胞炎性蛋白1α及胶质纤维酸性蛋白与高血压脑出血后血脑屏障的关系

目的探究血清tau蛋白、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平与高血压脑出血后血脑屏障损伤的关系。方法纳入2020年8月至2022年12月阳光融和医院收治的高血压脑出血患者180例作为研究组,选取同期来我院体检的健康人群180例作为对照组。根据白蛋白商值(QAlb)评估患者血脑屏障损伤,将研究组180例患者分为轻度组83例(QAlb 7.5~10)、中度组54例(10<QAlb≤30)、重度度组43例(QAlb>30)。对研究组180例患者展开6个月随访,根据改良的Rankin量表(mRS)评分评估预后,分为预后良好组119例(mRS评分0~2分)和预后不良组61例(mRS评分3~6分)。检测血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平,分析血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平与患者血脑屏障损伤和预后的关系。结果研究组血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平显著高于对照组(P<0.01)。中度组、重度组tau蛋白水平显著高于轻度组,重度组MIP-1α和GFAP水平显著高于轻度组(P<0.05)。预后不良组血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平显著高于预后良好组(P<0.01)。血清tau蛋白(r=0.532,P=0.000)、MIP-1α(r=0.487,P=0.001)和GFAP(r=0.571,P=0.000)分别与QAlb呈正相关。血清tau蛋白(r=0.507,P=0.000)、MIP-1α(r=0.425,P=0.004)和GFAP(r=0.533,P=0.000)分别与mRS评分呈正相关。ROC曲线分析显示,血清tau蛋白和MIP-1α及GFAP三者联合评估患者预后的曲线下面积为0.848(95%CI:0.787~0.897,P=0.000),显著高于三者单一检测。结论高血压脑出血患者血清tau蛋白、MIP-1α和GFAP水平较健康人群明显升高,与脑出血后血脑屏障损伤程度和预后密切相关。

基于磷脂酰肌醇3激酶与苏氨酸蛋白激酶1信号通路小檗碱调节巨噬细胞极化机制研究

目的探究小檗碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人髓系白血病单核细胞(THP-1)巨噬细胞极化的影响和可能作用机制。方法采用佛波酯(PMA)将THP-1细胞诱导成巨噬细胞,加入不同浓度的小檗碱,分别为对照组、小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组,干预24 h或48 h。采用细胞计数8试剂盒检测细胞活力,筛选小檗碱最佳浓度和时间。将PMA诱导的THP-1巨噬细胞分为空白组、模型组、小檗碱组、抑制剂组、小檗碱+抑制剂组。酶联免疫吸附测定检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))的含量;定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、精氨酸酶1(Arg1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)mRNA表达情况;Western blot检测Akt1和磷酸化Akt1(p-Akt1)抗体蛋白含量。结果干预24 h时,与对照组比较,小檗碱40μmol/L组和50μmol/L组巨噬细胞活性降低(P<0.05);干预48 h时,小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组巨噬细胞活性均低于对照组[(0.89±0.02)%、(0.82±0.03)%、(0.71±0.02)%、(0.62±0.03)%、(0.53±0.02)%vs(1.01±0.01)%,P<0.05]。小檗碱20μmol/L组处理24 h时对细胞活力影响不大,作为最佳浓度和时间。与空白组比较,模型组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,小檗碱组iNOS含量和TNF-αmRNA水平降低,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平升高(P<0.05);与小檗碱组比较,小檗碱+抑制剂组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论小檗碱可通过激活PI3K/Akt1通路,抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应,并抑制巨噬细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。

miRNA调控claudin-2表达对溃疡性结肠炎小鼠巨噬细胞极化的机制

目的探讨微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)通过封闭蛋白2(Recombinant,claudin-2)表达变化对溃疡性结肠炎小鼠的保护作用及对巨噬细胞极化的调控。方法选取BALB/c雌性小鼠按照体重随机分成对照组、模型组以及上调组和下调组,每组15只。对4组小鼠溃疡性结肠组织进行HE染色,观察分析小鼠溃疡性结肠炎评分情况、炎性因子、免疫细胞、巨噬细胞、claudin-2表达。结果与对照组比较,模型组、上调组、下调组miRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,上调组miRNA表达降低、下调组升高(P<0.05);与上调组比较,下调组miRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,上调miRNA第3 d、5 d、7 d的溃疡性结肠炎模型小鼠明显降低、下调组升高;与上调组比较,下调组miRNA表达升高(P<0.05);与对照组比较,模型组、上调组、下调组T淋巴细胞的糖蛋白(CD4^(+))、白细胞分化抗原(CD8^(+))水平升高(P<0.05);与模型组比较,上调组CD4^(+)、CD8^(+)水平降低,下调组升高(P<0.05);与上调组比较,下调组CD4^(+)、CD8^(+)水平升高(P<0.05);与对照组比较,模型组、上调组、下调组肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)水平升高(P<0.05);与模型组比较,上调组TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05);与上调组比较,下调组升高(P<0.05);与对照组比较,模型组、上调组、下调组诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平升高,巨噬细胞甘露糖受体(CD206)降低(P<0.05);与模型组比较,上调组iNOS水平降低、CD206水平升高,下调组iNOS水平升高、CD206水平降低(P<0.05);与上调组比较,下调组iNOS升高、CD206降低(P<0.05);与对照组比较,模型组、上调组、下调组claudin-2蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,上调组claudin-2蛋白表达降低、下调组claudin-2蛋白表达升高(P<0.05)。结论上调溃疡性结肠炎小鼠miRNA能够调节巨噬细胞极化,从而改善溃疡性结肠炎小鼠。

肿瘤相关巨噬细胞上调miR-221-3p可能参与了前列腺癌的恶性转移

目的探讨肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)上调miR-221-3p可能参与促进前列腺癌(PCa)恶性转移的作用机制。方法选择6例转移性PCa患者癌组织进行微小RNA(miRNAs)表达谱测序和差异表达miRNAs分析。分离上述转移性PCa患者癌组织中的原代TAMs。采用聚合酶链反应(qPCR)测定其中miR-221-3p的表达水平。向RAW264.7巨噬细胞转染miR-221-3p模拟物(mimic)或抑制物(inhibitor),然后与人PCa细胞系PC3细胞建立共培养体系。CCK-8法测定PC3细胞增殖能力,流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡率,Transwell法测定细胞迁移和侵袭能力,Western blot法测定细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白因子的表达水平。结果在6例转移性PCa患者的癌组织中,与淋巴结转移阴性PCa组织来源TAMs相比,淋巴结转移阳性PCa组织来源TAMs中hsa-miR-221-3p显著上调(P<0.05)。在共培养体系中,与Mimic-NC组相比,miR-221-3p mimic组PC3细胞增殖能力明显增强;迁移能力和侵袭能力明显增强;EMT相关蛋白因子表达水平明显增强(除E-Cadherin)(P均<0.05)。与Inhibitor-NC组相比,miR-221-3p inhibitor组细胞增殖能力明显降低,凋亡率明显升高;迁移能力和侵袭能力明显被抑制;EMT相关蛋白因子表达水平明显被抑制(除E-Cadherin)(P均<0.05)。结论TAMs上调miR-221-3p可能参与促进了PCa恶性转移。

基于CT征象和血清巨噬细胞集落刺激因子、β-连环蛋白构建的联合模型对孤立性肺结节的评估价值

目的探讨基于CT征象和血清巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、β-连环蛋白(β-Catenin)构建的联合模型对孤立性肺结节的评估价值。方法选取2020年2月至2023年2月萍乡市人民医院病理结果显示孤立性肺结节的105例患者作为研究对象,以孤立性肺结节性质为结局指标,软件计算建模组所需样本量为75例,故随机抽取75例作为建模组、其余30例作为验证组,分析建模组孤立性肺结节不同性质患者一般资料、CT征象、生化指标,多因素logistic回归分析法筛选影响孤立性肺结节性质的独立影响因子,并建立预测模型。用验证组临床资料进行验证并将验证组临床资料代入预测模型,根据预测概率绘制ROC曲线评估该预测模型的效能。结果建模组75例病例中,良性肺结节43例(57.33%)、恶性肺结节32例(42.67)。单因素分析结果显示,良性、恶性肺结节患者毛刺征、分叶征、血管集束征、胸膜凹陷征、磨玻璃密度、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、癌胚抗原(CEA)、神经特异性烯醇化酶(NSE)、M-CSF、β-Catenin水平与建模组孤立性肺结节性质有关,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示:毛刺征(β=1.572,OR=1.612,95%CI=1.475~2.159)、分叶征(β=1.484,OR=1.650,95%CI=1.408~2.184)、血管集束征(β=1.292,OR=1.674,95%CI=1.466~2.198)、磨玻璃密度(β=1.307,OR=1.785,95%CI=1.501~2.263)、CEA(β=0.915,OR=1.797,95%CI=1.505~2.199)、NSE(β=0.920,OR=1.824,95%CI=1.618~2.218)、M-CSF(β=0.859,OR=1.765,95%CI=1.506~2.301)、β-Catenin(β=0.867,OR=1.806,95%CI=1.542~2.325)是影响建模组孤立性肺结节性质的独立危险因素(P<0.05),据此建立的联合模型ROC曲线结果显示:该模型评估孤立性肺结节良恶性的灵敏度为90.50%、特异度为75.26%、AUC为0.880(95%CI=0.802~0.935)、阳性似然比为4.05、阴性似然比为0.12、阳性预测值为82.80%、阴性预测值为89.90%。结论毛刺征、分叶征、血管集束征、磨玻璃密度及CEA、NSE、M-CSF、β-Catenin水平升高是影响孤立性肺结节良恶性的独立影响因素,据此构建的联合模型评估孤立性肺结节良恶性的效能较高。

血清巨噬细胞炎症蛋白3α联合受体相互作用蛋白激酶3水平对乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者短期预后的预测效能

目的探讨血清巨噬细胞炎症蛋白3α(MIP-3α)联合受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)对乙型肝炎病毒相关的慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者短期预后的预测效能。方法选择2021年2月至2022年7月南京市第二医院收治的246例HBV-ACLF患者,检测血清MIP-3α、RIPK3水平,根据患者30 d内存活情况将其分为死亡组(73例)和存活组(173例)。比较两组临床资料,分析影响HBV-ACLF患者短期预后的因素及MIP-3α、RIPK3对HBV-ACLF患者预后的预测价值。结果死亡组血清白蛋白水平低于存活组,国际标准化比值、终末期肝病模型(MELD)评分、并发脑病比例及血清总胆红素、MIP-3α、RIPK3水平高于存活组(P<0.05)。MELD评分(OR=3.347,95%CI:1.844~6.073)及血清MIP-3α(OR=2.079,95%CI:1.307~3.309)、RIPK3(OR=2.004,95%CI:1.312~3.060)是HBV-ACLF患者短期预后的影响因素(P<0.05)。MELD评分及血清MIP-3α、RIPK3联合预测HBV-ACLF患者预后的受试者操作特征曲线下面积高于三者单独预测的曲线下面积(P<0.05)。结论HBV-ACLF患者血清MIP-3α、RIPK3水平升高,且与短期内死亡有关,MELD评分及血清MIP-3α、RIPK3联合分析有助于提示患者预后。

TRIB3靶向AKT磷酸化调控高糖条件下小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的机制研究

目的探讨TRIB3介导高糖条件下巨噬细胞促炎性M1型极化的下游机制。方法以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象:1)细胞分为对照(CON)组和高糖(HG)组,Western blot检测TRIB3、p-AKT和AKT蛋白;在各组内分为DMSO组和SC79组/MK2206组,使用AKT激动剂SC79或抑制剂MK2206处理细胞,Western blot检测p-AKT和AKT蛋白。2)细胞随机分为Control vector-DMSO组、TRIB3 overexpress-DMSO组、Control vector-SC79组、TRIB3 overexpress-SC79组、Control vector-MK2206组和TRIB3 overexpress-MK2206组,CCK8检测细胞活性,相差显微镜观察细胞形态并采集图像,Western blot检测TRIB3、pAKT、AKT、iNOS和Arg-1蛋白,ELISA检测细胞培养液中IL-1β和IL-10分泌。结果1)与CON组相比,HG组TRIB3显著增加、p-AKT/AKT显著下降。HG-SC79组p-AKT/AKT显著高于HG-DMSO组且与CON-SC79组无显著差异;HG-MK2206组pAKT/AKT显著低于HG-DMSO组。2)与对应的Control vector组相比,TRIB3 overexpress组TRIB3均显著增加、p-AKT/AKT均显著下降;与对应的DMSO组相比,SC79组p-AKT/AKT均显著增加、MK2206组p-AKT/AKT均显著下降。与Control vector-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-DMSO组出现较多长梭形和不规则形细胞,iNOS和IL-1β显著增加,IL-10显著减少。与TRIB3overexpress-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-SC79组长梭形和不规则形细胞明显减少,iNSO和IL-1β显著下降,IL-10显著增加;TRIB3 overexpress-MK2206组长梭形和不规则形细胞进一步增加,Arg-1和IL-10显著下降,IL-1β显著增加。结论高糖环境下巨噬细胞中激活的TRIB3蛋白通过靶向负调控AKT磷酸化水平发挥诱导巨噬细胞M1型极化、抑制M2型极化的促炎作用。

定心方抑制PI3K/Akt通路减轻脂质运载蛋白-2诱导巨噬细胞炎症反应的机制研究

目的:探讨定心方(DXR)含药血清对脂质运载蛋白-2(LCN2)诱导巨噬细胞炎症反应的保护作用及机制。方法:以LCN2作用RAW264.7巨噬细胞,分别加入空白血清、5%DXR含药血清、PI3K抑制剂LY294002及Akt抑制剂Triciribine,CCK-8法检测RAW264.7巨噬细胞活力,ELISA法检测细胞培养液炎症标记物白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平,Western blot检测巨噬细胞中IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达,透射电镜检测巨噬细胞自噬小体数量,免疫荧光标记自噬标记物LC3-II。结果:与LCN2组比较,DXR含药血清可显著减轻由LCN2诱导的巨噬细胞活力的下降,减少细胞培养液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平,下调巨噬细胞中IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达,增加巨噬细胞自噬小体数量,增加自噬标记物LC3-II表达,均有统计学意义(P<0.05)。与DXR含药血清组比较,LY294002及Triciribine可进一步加强DXR含药血清功效(P<0.05)。结论:DXR含药血清可显著减轻LCN2诱导的巨噬细胞炎症反应,其机制与抑制PI3K/Akt通路增加巨噬细胞自噬相关。

miR-223-3p调控NLRP3炎症小体对自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响

目的探讨miR-223-3p调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体的表达水平对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响。方法首先构建双荧光素酶报告质粒载体,并验证miR-223-3p对NLRP3基因表达的调控作用。然后将48只健康Lewis雌性大鼠随机分为正常对照(NC)组、EAU组和miR-223-3p慢病毒组,每组16只。EAU组和miR-223-3p慢病毒组大鼠首先用光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP)乳糜液诱导EAU模型,同时miR-223-3p慢病毒组每只大鼠双眼玻璃体内注射8μL携带miR-223-3p的慢病毒,造模12 d后麻醉处死大鼠,分离各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织。实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中miR-223-3p、NLRP3、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)的基因表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)以及NLRP3的蛋白表达水平;流式细胞仪检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中M1、M2型巨噬细胞水平。结果双荧光素酶表达报告系统检测证实NLRP3是miR-223-3p调控的靶基因。与NC组相比,造模12 d后,EAU组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中miR-223-3p的表达水平均降低(均为P<0.05),而NLRP3和iNOS的mRNA表达水平均升高(均为P<0.05),M1型巨噬细胞相关因子iNOS mRNA和TNF-α蛋白表达水平均升高(均为P<0.05),而M2型巨噬细胞相关因子Arg-1 mRNA和IL-10蛋白表达水平均降低(均为P<0.05);与EAU组相比,造模12 d后,miR-223-3p慢病毒组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中NLRP3 mRNA和蛋白表达水平均降低,iNOS mRNA和TNF-α蛋白表达水平均降低,而Arg-1 mRNA和IL-10蛋白表达水平均升高(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与NC组相比,造模12 d后,EAU组大鼠M1型巨噬细胞极化水平升高,而M2型巨噬细胞极化水平降低,M1/M2巨噬细胞比例升高(均为P<0.05);与EAU组相比,造模12 d后,miR-223-3p慢病毒组大鼠M1型巨噬细胞极化水平降低,而M2型巨噬细胞极化水平升高,M1/M2巨噬细胞比例逐渐恢复平衡(均为P<0.05)。结论EAU大鼠体内巨噬细胞极化失衡,提高miR-223-3p水平可抑制NLRP3炎症小体的表达,进而抑制炎症相关信号通路,降低M1型巨噬细胞极化水平以及提高M2型巨噬细胞极化水平,从而发挥对葡萄膜炎大鼠巨噬细胞极化平衡的调控作用。

巨噬细胞炎性蛋白1α对人牙周膜干细胞生物学行为的影响

背景:目前大量研究集中于炎症因子对人牙周膜干细胞的影响,然而关于趋化因子巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)在人牙周膜干细胞中的表达,国内外相关文献报道较少。目的:探究不同质量浓度MIP-1α对人牙周膜干细胞增殖、凋亡及迁移的影响及与Notch信号通路的相关性。方法:将12-25岁患者(均签署知情同意书)拔下的健康正畸减数前磨牙,通过组织块法联合酶消化法分离培养人牙周膜干细胞。将第3代对数生长期人牙周膜干细胞分为对照组和1,10,100 mg/L MIP-1α组,干预第1,3,5,7天采用CCK-8法检测细胞增殖能力,干预48 h采用流式检测细胞凋亡能力,Transwell小室检测细胞迁移能力,ELISA检测分泌肿瘤坏死因子α水平,qRT-PCR、Western blot检测Notch1、Hes1mRNA和蛋白表达量。结果与结论:(1)1 mg/L MIP-1α对人牙周膜干细胞生物学行为无明显影响,10 mg/L MIP-1α显著促进人牙周膜干细胞的增殖及迁移,而100 mg/L MIP-1α显著促进人牙周膜干细胞的凋亡,抑制人牙周膜干细胞的增殖和迁移;(2)1 mg/L MIP-1α对人牙周膜干细胞中Notch1及Hes1蛋白表达无明显影响;10 mg/L MIP-1α对人牙周膜干细胞中Notch1蛋白表达无显著影响,但可下调细胞中Hes1蛋白表达水平,100 mg/L MIP-1α可上调细胞中Notch1及Hes1蛋白表达水平;(3)1 mg/L MIP-1α组人牙周膜干细胞分泌的肿瘤坏死因子α水平与对照组无显著差异;10 mg/L MIP-1α促进肿瘤坏死因子α分泌;100 mg/L MIP-1α抑制肿瘤坏死因子α分泌;(4)结果表明:10 mg/L MIP-1α促进人牙周膜干细胞增殖、迁移及肿瘤坏死因子α分泌,其机制可能与下调Notch信号通路相关;100 mg/L MIP-1α抑制人牙周膜干细胞增殖、迁移及肿瘤坏死因子α分泌,促进人牙周膜干细胞凋亡,其机制可能与上调Notch信号通路有关。

慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血巨噬细胞极化和TXNIP/NLRP3水平与预后的关系探讨

目的探讨慢加急性乙型肝炎肝衰竭(HBV-ACLF)患者外周血巨噬细胞极化和外周血单个核细胞(PBMCs)硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)水平变化.方法2019年6年~2020年6月我院收治的HBV-ACLF患者57例和慢性乙型肝炎(CHB)患者43例,使用流式细胞仪检测外周血M1/M2型巨噬细胞比率,分离PBMCs,采用实时荧光定量RT-PCR法检测TXNIP、NLRP3和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)mRNA水平,采用ELISA法检测血清白介素-6(IL)-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α(TNF-α).结果HBV-ACLF组M1型巨噬细胞比率和M1/M2细胞比值分别为(3.5±0.4)%和(1.2±0.2),显著高于CHB组[分别为(2.1±0.2)%和(0.6±0.1),P<0.05],而M2型巨噬细胞比率为(2.5±0.3)%,显著低于CHB组[(4.1±0.4)%,P<0.05];HBV-ACLF组血清IL-6和TNF-α水平分别为(37.9±4.2)ng/L和(2.3±0.2)pg/mL,显著高于CHB组[分别为(28.8±3.6)ng/L和(1.2±0.1)pg/mL,P<0.05],而血清IL-10水平为(1.4±0.2)pg/mL,显著低于CHB组[(2.9±0.3)pg/mL,P<0.05];HBV-ACLF组PBMCs NLRP3、TXNIP和caspase-1 mRNA水平分别为(0.5±0.1)、(0.7±0.1)和(1.2±0.1),显著低于CHB组[分别为(0.8±0.2)、(1.0±0.1)和(1.6±0.2),P<0.05];15例死亡患者外周血M1型巨噬细胞比率为(4.1±0.4)%,显著高于42例生存组[(3.3±0.3)%,P<0.05],而M2型巨噬细胞比率、PBMCs NLRP3和TXNIP mRNA水平分别为(1.9±0.2)%、(0.2±0.1)和(0.4±0.1),显著低于生存组[分别为(2.7±0.3)%、(0.6±0.1)和(0.8±0.1),P<0.05].结论HBV-ACLF患者外周血巨噬细胞向促炎方向极化,而TXNIP和NLRP3 mRNA水平下调可能与免疫功能被抑制有关.

CD1a、巨噬细胞炎性蛋白3α及上皮细胞钙黏素mRNA在尖锐湿疣组织中的表达

目的:研究尖锐湿疣(CA)组织中朗格汉斯细胞(Langerhans’cell,LC)表面标志分子CD1a、趋化因子巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP-3α)及黏附分子上皮细胞钙黏素(E-cadherin)mRNA表达,探讨CA局部LC改变的分子机制。方法:采用反转录(RT)-PCR法检测26例CA组织中CD1a、MIP-3α、E-cadherin的表达情况,并以10名正常人包皮组织作为对照。结果:①与正常对照组(0.7444±0.3667)相比,CA组织中CD1a mRNA表达(0.4066±0.2671)显著降低(P<0.01),MIP-3α mRNA表达(0.3181±0.1632)低于正常对照组(0.6163±0.1939)(P<0.01),E-cadherin mRNA表达(0.1737±0.1083)较正常对照组(0.3786±0.1460)显著降低(P<0.01)。②CD1a和MIP-3α分子mRNA的表达呈正相关(r=0.9533,P<0.01),CD1a和E-cadherin分子mRNA的表达也呈正相关(r=0.8381,P<0.05)。结论:CA组织中存在LC缺失和抗原提呈功能下降,LC的减少可能与表皮MIP-3α表达下降,进而导致LC前体细胞难以到达表皮有关,还可能与E-cadherin表达下降导致LC在表皮内难以滞留有关。

MRI参数与巨噬细胞炎性蛋白3α和鼻咽癌病理特征的关系

目的通过MRI增强扫描参数与检测血清巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP-3α)在鼻咽癌患者中的表达情况,探讨其在鼻咽癌诊断、与临床病理特征关系以及疗效评价中的作用。方法应用定量ELISA检测120例初治无远处转移的鼻咽癌患者血清MIP-3α的表达和MRI增强扫描参数情况。结果 120例鼻咽癌患者经过治疗后均达到完全缓解或部分缓解,鼻咽癌患者活检部位的MRI动态参数与血清MIP-3α表达呈正相关(P <0.05);鼻咽癌患者血清MIP-3α水平高于健康对照者。不同T分期、N分期及临床分期患者的曲线最大上升斜率比较,差异有统计学意义(P <0.05);MIP-3α与鼻咽癌临床分期相关,MIP-3α还与T分期有关(P<0.05)。治疗后完全缓解患者的血清MIP-3α降至健康对照者水平,部分缓解患者仍高于健康对照者水平;鼻咽癌患者活检部位的MRI动态参数与血清MIP-3α表达呈正相关。结论血清MIP-3α水平作为辅助诊断鼻咽癌的指标有一定的临床意义,其与磁共振增强扫描参数与检测有助于判断鼻咽癌分期和治疗后的近期疗效。

1,25(OH)_2D_3干预IL-17及巨噬细胞炎性蛋白3α表达抑制大鼠肝纤维化形成的作用机制

目的探讨在肝纤维化形成过程中肝组织及外周血中IL-17和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)3α的表达变化,以及1,25(OH)2D3经干预IL-17通路抑制肝纤维化形成的作用机制。方法 48只SD大鼠随机分为4组:正常组(橄榄油)、模型组(CCl4橄榄油溶液)、药物对照组(CCl4橄榄油溶液+橄榄油灌胃)、治疗组(CCl4橄榄油溶液+1,25(OH)2D3橄榄油溶液灌胃)。8周后取肝组织行HE染色和Masson染色,并对其纤维化程度进行病理分期;采用ELISA法检测干预后不同时间点(4、6、8周)血清中IL-17水平;免疫组化法分析不同时间点(4、6、8周)各组大鼠肝组织IL-17和MIP3α的蛋白表达;real time-PCR法检测第8周各肝组织IL-17和MIP3α的mRNA表达。计量资料的组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验,相关性检验采用直线相关分析。结果 8周时模型组及药物对照组肝纤维化显著,治疗组肝纤维化程度明显减轻。4组间各个时间点(4、6、8周)血清IL-17水平比较差异均有统计学意义(F值分别为6.13、5.79、7.18,P值均<0.05);正常组血清IL-17水平很低,各个时间点(4、6、8周)模型组及药物对照组血清IL-17水平与正常组比较显著升高(P值均<0.01);治疗组各时间点血清中IL-17表达水平较模型组和药物对照组均显著降低(P值均<0.05),但均以第4周表达水平最高。免疫组化和real time-PCR法检测显示,对照组肝组织中几乎不表达IL-17,且MIP3α表达甚微;随着肝纤维化的进展,血清中IL-17水平逐渐降低,肝组织中IL-17水平逐渐升高(r=-0.793,P<0.01);4组间各时间点(4、6、8周)肝组织表达IL-17、MIP3α水平差异有统计学意义(IL-17:F值分别为11.02、9.61、7.45,P值均<0.05;MIP3α:F值分别为9.47、8.93、6.15,P值均<9.05);模型组及药物对照组各时间点(4、6、8周)肝组织表达IL-17、MIP3α蛋白较正常组均显著升高(P值均<0.01),治疗组肝组织各时间点表达量较模型组和药物对照组均明显降低且差异均有统计学意义(P值均<0.05),均于第8周时表达量最高。模型组及药物对照组第8周IL-17、MIP3αmRNA表达水平较正常组明显增多,治疗组较药物对照组和模型组显著减少,组间比较差异有统计学意义(F值分别为7.36、10.15,P值均<0.05)。结论 (1)在肝纤维化发生发展过程中,血清IL-17水平先升高后降低,而肝组织中IL-17表达水平呈逐渐升高趋势,提示肝纤维化后期血清中Th17渐被趋于肝脏;(2)1,25(OH)2D3治疗组肝脏中IL-17和MIP3α蛋白及mRNA水平较模型组及药物对照组均明显降低,提示IL-17通路可能为1,25(OH)2D3抑制肝纤维化发生发展的作用机制之一。

鞣花酸通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB途径抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

目的基于Toll样受体4(TLR4)-酪氨酸激酶(SRC)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路探讨鞣花酸的抗炎机制。方法采用不同浓度(0、0.5、5、25、50、75、100μmol·L^(-1))鞣花酸对RAW264.7巨噬细胞[或脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞]干预24 h,噻唑蓝(MTT)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适给药浓度。实验分为空白对照组,模型组(0.5 mg·L^(-1)LPS),阳性对照地塞米松组(10μmol·L^(-1)),鞣花酸(5、25、50μmol·L^(-1))给药组。Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素-2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平;采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白以及TLR4-SRC/MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达水平。结果MTT结果筛选出鞣花酸的干预浓度为5~50μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,模型组PGE_(2)、NO和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.01);炎症标志物iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),说明炎症模型建立成功。与模型组比较,鞣花酸能显著抑制LPS诱导NO、PGE_(2)的产生和降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05,P<0.01),降低i NOS、COX-2蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;显著抑制TLR4蛋白的表达水平以及SRC、P38、JNK、p65、IκBα蛋白的磷酸化水平,并呈浓度依赖性。但对ERK1/2蛋白磷酸化没有显示出明显的抑制作用。结论鞣花酸可能通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB信号通路的调控抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,具体的调控机制有待进一步研究。

巨噬细胞炎性反应蛋白3β复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建小鼠巨噬细胞炎性反应因子-3β(mMIP3β)的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-mMIP3β),并在体外表达MIP3β。方法通过在细菌BJ5183内同源重组,利用AdEasyTM系统构建Ad-mMIP3β,经过噬斑筛选、PCR鉴定,然后用CsCl不连续密度梯度离心纯化。利用RT-PCR和Western blot方法研究Ad-mMIP3β的体外表达情况。结果成功构建了MIP3β的复制缺陷型重组腺病毒,并检测到分泌到胞外的MIP3β蛋白。结论MIP3β的复制缺陷型重组腺病毒构建成功,为下一步的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。

Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5抑制巨噬细胞焦亡的作用机制

背景:Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)是一种肌肉因子,具有调节糖脂代谢、抗炎、抗氧化及改善胰岛素抵抗等功能,并且具有调节多种细胞焦亡的能力。目的:探讨FNDC5对巨噬细胞焦亡的作用及潜在机制。方法:(1)构建FNDC5基因过表达和沉默慢病毒载体,将慢病毒载体转染至THP-1细胞株,通过观察细胞绿色荧光表达、qPCR和Western blot验证转染效果。(2)佛波酯诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,通过氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)构建巨噬细胞焦亡模型,分组:NC组、ox-LDL组、ox-LDL+MOCK1组、ox-LDL+Ov-FNDC5组、ox-LDL+MOCK2组和ox-LDL+shFNDC5组。(3)采用Hoechst 33342/PI荧光双染和乳酸脱氢酶释放实验评估细胞焦亡程度,采用qPCR和Western blot检测相关分子mRNA和蛋白表达水平,采用ELISA检测细胞上清液中白细胞介素1β和白细胞介素18释放水平。结果与结论:与ox-LDL+MOCK1组相比,过表达FNDC5可显著降低巨噬细胞焦亡率以及乳酸脱氢酶、白细胞介素1β、白细胞介素18释放水平,显著抑制NF-κB p65、NF-κB p50、NLRP3、ASC、Caspase-1及GSDMD的mRNA表达,显著抑制NF-κB p65、NF-κB p50、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1及GSDMD-N的蛋白表达;与ox-LDL+MOCK2组相比,沉默FNDC5则出现相反结果。结果表明:FDNC5可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路缓解巨噬细胞焦亡。

糖基化终产物对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA表达的影响

目的探讨糖基化终产物(AGEs)对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白-1αmRNA表达的影响,及AGEs在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法将U937细胞用不同浓度(100、200、400 mg/L)AGEs孵育24 h及同一浓度(400 mg/L)AGEs孵育0、12、24及36 h,采用原位杂交(PT-PCR)方法检测巨噬细胞炎性蛋白-1αmRNA的表达水平。结果对照组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白-1α呈弱表达;100、200及400 mg/LAGEs孵育24 h后,各组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白-1αmRNA表达的平均积分光密度值较对照组均显著升高(P<0.05);400 mg/L AGEs孵育12、24及36 h后,各组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白-1αmRNA表达的平均积分光密度值均高于0 h(P<0.05)。结论AGEs以时间及剂量依赖的方式促进U937细胞巨噬细胞炎性蛋白-1αmRNA的表达。

HTRA3基因对脉络膜新生血管和M2型巨噬细胞极化的影响

目的 探讨HtrA丝氨酸肽酶3(HTRA3)基因对脉络膜新生血管(CNV)和M2型巨噬细胞极化的影响。方法 收集30例湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)患者(wAMD组)和30例同期健康体检者(健康组)的空腹静脉血,通过qRT-PCR检测血清HTRA3 mRNA水平。将RF/6A细胞随机分为对照组、NC-sh组和HTRA3-sh组,使用Lipofectamine2000将NC-shRNA和HTRA3-shRNA慢病毒载体分别转染到NC-sh组和HTRA3-sh组RF/6A细胞中,通过qRT-PCR和Western blot检测HTRA3的转染情况。将RF/6A细胞随机分为N组、H组、H+NC-sh组和H+HTRA3-sh组,细胞转染后,N组RF/6A细胞在完全RPMI 1640培养基中进行常氧培养,其他组细胞在添加200 mmol·L^(-1)氯化钴(CoCl_(2))的RPMI 1640培养基中进行低氧培养,使用Matrigel测定小管形成。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、CNV组、CNV+NC-sh组和CNV+HTRA3-sh组,每组12只。对照组为未建模的小鼠,其他组为激光诱导的CNV模型小鼠。向CNV+NC-sh组和CNV+HTRA3-sh组小鼠玻璃体内分别注射1μL滴度为1×10^(11)TU·mL^(-1)的NC-shRNA和HTRA3-shRNA慢病毒载体。对照组和CNV组小鼠注射PBS。注射后7 d,对小鼠进行荧光素眼底血管造影(FFA)检测和眼球苏木精伊红(HE)染色。通过qRT-PCR检测RF/6A细胞或各组小鼠脉络膜组织中HTRA3、类几丁质酶3样蛋白3(Ym-1)、精氨酸酶1(Arg-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平。通过Western blot检测RF/6A细胞或脉络膜组织中HTRA3、VEGF和细胞核核因子κB(NF-κB) p65的蛋白表达水平。结果 与健康组比较,wAMD组患者的血清HTRA3 mRNA水平升高(t=11.804,P<0.001)。与对照组和NC-sh组比较,HTRA3-sh组RF/6A细胞的HTRA3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。与N组比较,H组RF/6A细胞的闭合管腔数量、HTRA3和VEGF的mRNA和蛋白表达水平均增加(均为P<0.05)。与H+NC-sh组比较,H+HTRA3-sh组RF/6A细胞的闭合管腔数量、HTRA3和VEGF的mRNA和蛋白表达水平均减少(均为P<0.05)。与对照组比较,CNV组小鼠的HTRA3的mRNA和蛋白表达水平增加,CNV相对荧光强度升高,Ym-1和Arg-1 mRNA水平升高,iNOS和COX-2 mRNA水平降低,细胞核NF-κB p65蛋白表达水平升高(均为P<0.05)。与CNV+NC-sh组比较,CNV+HTRA3-sh组小鼠的HTRA3的mRNA和蛋白表达水平减少,CNV相对荧光强度降低,Ym-1和Arg-1 mRNA水平降低,iNOS和COX-2 mRNA水平升高,细胞核NF-κB p65蛋白表达水平降低(均为P<0.05)。结论 下调HTRA3可抑制CNV形成和M2型巨噬细胞极化,HTRA3可能是防治wAMD的重要潜在靶点。