牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松(DEX)诱导的RAW264.7细胞系凋亡(P<0.01)。1μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用(P<0.05);10μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有显著的促进作用(P<0.05)。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有极显著的促进作用(P<0.01),但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。

菊粉对巨噬细胞RAW 264.7免疫活性的影响

菊粉(inulin,INU)作为一种植物多糖,因具有广泛的应用价值以及增强免疫、抗炎、抗肿瘤等生物学功能而备受关注,本研究旨在探究INU对巨噬细胞RAW 264.7免疫活性的影响。采用细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)、中性红试验检测INU对巨噬细胞RAW 264.7增殖活性和吞噬活性的影响。采用格里斯试剂法和免疫酶联吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞中一氧化氮(nitric oxide,NO)和细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的释放量。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)检测细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的基因表达量以及免疫蛋白印迹(Western blotting,WB)检测INU对巨噬细胞RAW 264.7中环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和丝裂原蛋白活化激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)相关通路关键蛋白表达的影响。实验结果表明,INU显著增强RAW 264.7细胞的增殖活性、吞噬活性并促进NO的分泌及IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平(P<0.01)。此外,INU还以浓度依赖的方式显著上调了COX2、iNOS及MAPK通路中磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulatory protein kinase,p-ERK)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38)的蛋白表达(P<0.01)。综上所述,INU可通过ERK/p38MAPK通路调控巨噬细胞的免疫活性,具有良好的免疫调节能力。

TRIB3靶向AKT磷酸化调控高糖条件下小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的机制研究

目的探讨TRIB3介导高糖条件下巨噬细胞促炎性M1型极化的下游机制。方法以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象:1)细胞分为对照(CON)组和高糖(HG)组,Western blot检测TRIB3、p-AKT和AKT蛋白;在各组内分为DMSO组和SC79组/MK2206组,使用AKT激动剂SC79或抑制剂MK2206处理细胞,Western blot检测p-AKT和AKT蛋白。2)细胞随机分为Control vector-DMSO组、TRIB3 overexpress-DMSO组、Control vector-SC79组、TRIB3 overexpress-SC79组、Control vector-MK2206组和TRIB3 overexpress-MK2206组,CCK8检测细胞活性,相差显微镜观察细胞形态并采集图像,Western blot检测TRIB3、pAKT、AKT、iNOS和Arg-1蛋白,ELISA检测细胞培养液中IL-1β和IL-10分泌。结果1)与CON组相比,HG组TRIB3显著增加、p-AKT/AKT显著下降。HG-SC79组p-AKT/AKT显著高于HG-DMSO组且与CON-SC79组无显著差异;HG-MK2206组pAKT/AKT显著低于HG-DMSO组。2)与对应的Control vector组相比,TRIB3 overexpress组TRIB3均显著增加、p-AKT/AKT均显著下降;与对应的DMSO组相比,SC79组p-AKT/AKT均显著增加、MK2206组p-AKT/AKT均显著下降。与Control vector-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-DMSO组出现较多长梭形和不规则形细胞,iNOS和IL-1β显著增加,IL-10显著减少。与TRIB3overexpress-DMSO组相比,TRIB3 overexpress-SC79组长梭形和不规则形细胞明显减少,iNSO和IL-1β显著下降,IL-10显著增加;TRIB3 overexpress-MK2206组长梭形和不规则形细胞进一步增加,Arg-1和IL-10显著下降,IL-1β显著增加。结论高糖环境下巨噬细胞中激活的TRIB3蛋白通过靶向负调控AKT磷酸化水平发挥诱导巨噬细胞M1型极化、抑制M2型极化的促炎作用。

模拟失重对小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学功能的影响

目的通过2D回转器回转细胞模拟失重生物学效应,探讨模拟失重对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)多种生物学功能的影响特点,为深化空间失重免疫抑制机制研究提供理论依据和数据支撑。方法将RAW264.7细胞分为对照组(NG组)、模拟失重组(SMG组),利用2D回转器模拟失重72 h后,采用CCK-8法和EdU法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞的增殖能力变化;细胞划痕实验和Transwell小室法检测巨噬细胞迁移功能的变化;探针DCFH-DA标记,倒置荧光显微镜观察和拍照检测巨噬细胞分泌活性氧(ROS)的变化。结果RAW264.7巨噬细胞模拟失重72 h后增殖受到抑制,CCK-8实验结果显示,NG组的细胞增殖速率显著高于SMG组(P<0.05);EdU染色结果显示,SMG组EdU掺入RAW264.7细胞核的量较NG组减少(P<0.01)。细胞划痕、Transwell实验检测表明72 h模拟失重对巨噬细胞的迁移能力有明显影响,与NG组相比,模拟失重后RAW264.7细胞迁移能力增强(P<0.05);探针DCFH-DA标记检测提示模拟失重对巨噬细胞分泌ROS有明显抑制作用(P<0.01)。结论回转模拟失重对RAW264.7细胞的生物学功能具有影响,表现为RAW264.7迁移运动能力增强,细胞增殖与ROS分泌能力受到抑制。

依达拉奉对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨依达拉奉(EDA)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用。方法 以脂多糖诱导RAW264.7细胞,复制炎性细胞模型。采用CCK-8法检测EDA的细胞毒性作用。实验分为空白组(等体积培养基)、模型组(等体积培养基)、给药组(40μg/mL EDA)。采用Griess法检测细胞中一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法测定细胞中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞中JAK2/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路相关蛋白JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,IL-1β,IL-18的蛋白表达水平。结果 与0μg/mL比较,20,40,80,160μg/mL EDA处理下细胞存活率无显著变化(P <0.05)。与模型组比较,给药组细胞中NO,PGE2,IL-1β,IL-18,TNF-α,ROS水平均显著降低(P <0.05);IL-1β与IL-18 mRNA及蛋白表达水平和p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3均显著降低(P <0.05)。结论 EDA可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活而抑制RAW264.7细胞的炎性反应。

植物乳植杆菌IMAU30043胞外多糖对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞氧化损伤的保护作用

为探究植物乳植杆菌IMAU30043胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)对RAW264.7巨噬细胞氧化损伤的保护作用,作者以还原能力、超氧阴离子自由基抑制能力和DPPH自由基清除能力来评价EPS的体外抗氧化水平。通过离子色谱分析IMAU30043EPS的组成,并采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞建立氧化损伤模型,测定其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)质量摩尔浓度、NO质量摩尔浓度及炎症因子表达水平的变化。根据Nrf2/HO-1/NF-κB通路关键基因表达水平的变化,探讨EPS保护细胞免受氧化损伤和抑制炎症反应的作用机制。结果表明,IMAU30043 EPS的体外抗氧化活性最强,由岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸组成,其摩尔比为4.50∶51.49∶256.73∶95.96∶3.64∶5.35∶111.10∶16.93。另外,EPS可显著提高LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞氧化损伤后的SOD酶活力,降低MDA和NO质量摩尔浓度;在基因水平上能显著下调iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量,但显著上调IL-10的表达量。此外,EPS促进了模型细胞中Nrf2和HO-1基因的mRNA表达,并抑制了NF-κB的激活。表明植物乳植杆菌IMAU30043产生的EPS能有效保护巨噬细胞免受氧化损伤,且该功能与Nrf2/HO-1/NF-κB信号通路有关。

鞣花酸通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB途径抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

目的基于Toll样受体4(TLR4)-酪氨酸激酶(SRC)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路探讨鞣花酸的抗炎机制。方法采用不同浓度(0、0.5、5、25、50、75、100μmol·L^(-1))鞣花酸对RAW264.7巨噬细胞[或脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞]干预24 h,噻唑蓝(MTT)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适给药浓度。实验分为空白对照组,模型组(0.5 mg·L^(-1)LPS),阳性对照地塞米松组(10μmol·L^(-1)),鞣花酸(5、25、50μmol·L^(-1))给药组。Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素-2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平;采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白以及TLR4-SRC/MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达水平。结果MTT结果筛选出鞣花酸的干预浓度为5~50μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,模型组PGE_(2)、NO和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.01);炎症标志物iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),说明炎症模型建立成功。与模型组比较,鞣花酸能显著抑制LPS诱导NO、PGE_(2)的产生和降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05,P<0.01),降低i NOS、COX-2蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;显著抑制TLR4蛋白的表达水平以及SRC、P38、JNK、p65、IκBα蛋白的磷酸化水平,并呈浓度依赖性。但对ERK1/2蛋白磷酸化没有显示出明显的抑制作用。结论鞣花酸可能通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB信号通路的调控抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,具体的调控机制有待进一步研究。

文冠果叶黄酮对巨噬细胞RAW264.7细胞因子及TLR2受体的影响

通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法分析文冠果叶黄酮(XLF)对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响,酶联免疫吸附测定法检测巨噬细胞RAW 264.7分泌的细胞因子含量;通过XLF处理Toll样受体2(TLR2)抗体作用的巨噬细胞,研究TLR2受体对该细胞因子的介导作用。结果表明:当XLF质量浓度为320μg/mL时,巨噬细胞RAW 264.7分泌的NO、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)细胞因子最多,且与空白对照差异极显著,但都小于脂多糖(LPS);且与未加入TLR2抗体相比,加入了TLR2抗体的巨噬细胞减少了各细胞因子的分泌,且差异均极显著。XLF可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖及细胞因子的分泌,并且可能通过TLR2受体介导。

显齿蛇葡萄醇提物含药血清对脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7炎症模型的抗炎作用

目的:采用血清药物化学的研究方法,分析显齿蛇葡萄醇提物(AGEE)大鼠口服后的入血成分,基于入血成分研究AGEE含药血清对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞炎症的抗炎作用。方法:12只SD大鼠随机分为AGEE组和空白组,分别给予AGEE(5.4 g/kg)和纯净水灌胃,以制备含药血清和空白血清,采用HPLC-DAD分析其含药血清色谱图,通过与空白血清色谱图对比分析,探讨AGEE的体内移行成分。以RAW264.7细胞为研究对象,将细胞分为5%或15%空白血清组,5%或15%空白血清+LPS组,以及5%或15%含药血清+LPS组,按相应条件培养24 h后,采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测每组细胞存活率;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞中TNF-α、IL-6、IL-10水平。结果:AGEE含药血清与空白血清比较,发现16个色谱峰,其中9种为原型成分入血,7种可能是AGEE在大鼠体内产生的代谢物。CCK-8检测结果表明,各组细胞按上述条件培养24 h后均未发现毒性。5%或15%空白血清+LPS组细胞中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于5%或15%空白血清组(P<0.01或P<0.05)。15%含药血清+LPS组细胞中TNF-α水平低于5%空白血清+LPS组(P<0.05);5%或15%含药血清+LPS组细胞IL-6水平低于5%或15%空白血清+LPS组(P<0.01);5%或15%含药血清+LPS组细胞IL-10水平高于5%或15%空白血清+LPS组(P<0.01或P<0.05)。结论:建立了AGEE含药血清HPLC-DAD分析方法,明确了其活性物质基础。AGEE含药血清可降低LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应。

敲低双特异性磷酸酶5(DUSP5)通过阻断NF-κB信号抑制卡介苗诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的探讨双特异性磷酸酶5(DUSP5)对卡介苗(BCG)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应的调控作用。方法Western blot法检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞0.5、1、2、4、6、8、12、24 h,DUSP5表达变化;采用小干扰RNA(siRNA)技术下调RAW264.7巨噬细胞DUSP5水平,并设置siRNA阴性对照(si-NC)组、DUSP5敲低(si-DUSP5)组、si-NC联合BCG感染组、si-DUSP5联合BCG感染组。实时定量PCR检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量;Western blot法检测细胞核因子κB(NF-κB)与磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达变化。结果BCG感染上调RAW264.7巨噬细胞核DUSP5蛋白表达,并在BCG刺激4 h后,DUSP5表达量达到高峰;与si-NC联合BCG感染组相比,敲低DUSP5抑制细胞促炎因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达与分泌,而抑炎因子IL-10表达不受DUSP5的影响;且敲低DUSP5抑制细胞NF-κB磷酸化。结论敲低DUSP5通过阻断NF-κB信号抑制BCG介导的巨噬细胞炎性反应。

ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

目的探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体,通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况,酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量;用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化,分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响;检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的相对表达情况,分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰;在时相上,除琥珀酰修饰外,随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势,其中以6 h乳酰化修饰最多;ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响;经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上,IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6~8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式,改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。

大粒车前子多糖对脂多糖刺激RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

采用脂多糖构建RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究大粒车前子多糖的抗炎作用。培养巨噬细胞RAW264.7,利用脂多糖构建细胞炎症模型,中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;酶联免疫吸附法检测车前子精制多糖(Plantago asiatica L.crude polysaccharide,PLCP)处理前后细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和IL-6的分泌量,Griess反应测定RAW264.7细胞释放NO水平。结果表明,PLCP可显著抑制RAW264.7炎症细胞的吞噬活性,降低炎症细胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌量及NO的释放量。

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用

目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCI、II类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。

牡丹花蕊黄酮对H_2O_2诱导RAW264.7巨噬细胞损伤的保护作用

目的:研究牡丹花蕊黄酮对H_2O_2诱导损伤的RAW264.7巨噬细胞的保护作用。方法:实验分为空白组、H_2O_2损伤组、VC对照组和牡丹花蕊黄酮低、中、高剂量组。应用H_2O_2建立RAW264.7巨噬细胞氧化损伤模型,噻唑蓝法测定细胞存活率,试剂盒法测定细胞和细胞培养液中谷胱甘肽和丙二醛含量及过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶活力。结果:牡丹花蕊黄酮的质量浓度在10～30μg/mL范围内时,可显著促进RAW264.7巨噬细胞的增殖(P<0.05)。与H2O2损伤组相比,牡丹花蕊黄酮各剂量组能够提高细胞及细胞培养液中总抗氧化能力,谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物酶、过氧化氢酶活力以及还原型谷胱甘肽含量,降低细胞及细胞培养液中丙二醛含量,提高细胞内乳酸脱氢酶的水平。结论:牡丹花蕊黄酮可以促进RAW264.7巨噬细胞的增殖,提高H_2O_2损伤的RAW264.7巨噬细胞的抗氧化能力,且存在剂量依赖效应。

姜黄素促进RAW264.7源性M1巨噬细胞向替代激活M2表型极化

目的观察姜黄素对LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)极化的影响及机制。方法不同浓度姜黄素(6.25、12.5、25μmol/L)干预LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)12h,同时再加入20μmol/L GW9662与25μmol/L姜黄素共同干预LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)12h,采用Real-time PCR、ELISA及Western blot方法检测IL-1β、IL-6和M2表型标志分子KLF4、FIZZ1、MGL1、PPARγ的表达,及阻断PPARγ后KLF4和FIZZ1的表达。结果不同浓度姜黄素均能上调LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)的M2标志分子的表达,并且抑制炎症因子IL-1β和IL-6的分泌;阻断PPARγ后,RAW264.7巨噬细胞源性M1表型巨噬细胞表达M2标志分子下调。结论姜黄素通过活化PPARγ促进LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)向M2表型极化。

木犀草素对活化的RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的炎症是机体的一种防御性反应,但过度的炎症又会导致机体损伤。文中旨在探讨木犀草素对LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响及机制。方法将细胞分为对照组、LPS+IFN-γ组、木犀草素低、中、高剂量组。对照组:不加药的RAW264.7细胞;LPS+IFN-γ组:终浓度为10 ng/m L LPS+20 ng/m L IFN-γ刺激细胞M1极化;木犀草素低剂量组:LPS+IFN-γ与终浓度为5μmol/L的木犀草素同时刺激;木犀草素中剂量组:LPS+IFN-γ与10μmol/L的木犀草素共同刺激;木犀草素高剂量组:LPS+IFN-γ与20μmol/L的木犀草素共同刺激。激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化;Real time-q PCR检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、IL-1β和IL-6基因的表达,ELISA检测上清TNF-α和IL-6的分泌,Western blot检测蛋白通路phospho-STAT3(ser727)(p-STAT3)的变化。结果活化的RAW264.7细胞形态发生明显变化,与对照组比较,其余4组i NOS、IL-1β、IL-6均降低(P<0.05);与LPS+IFN-γ组i NOS(98.91±10.65)比较,木犀草素高剂量组(29.52±3.07)明显降低(P<0.01);与LPS+IFN-γ组IL-1β(110.69±4.12)比较,木犀草素中剂量组、木犀草素高剂量组(78.38±8.65、41.59±6.80)明显降低(P<0.05),与LPS+IFN-γ组IL-6(394.10±33.47)比较,木犀草素低、中、高剂量组(177.51±19.28、106.14±5.63、27.15±1.26)明显降低(P<0.05)。LPS+IFN-γ能诱导RAW264.7细胞M1表型的p-STAT3(ser727)上调,与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组p-STAT3明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组M1源性的p-STAT3-ser表达下调(P<0.05),并呈剂量依赖性。与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组IL-6、TNF-α表达明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组IL-6、TNF-α表达明显下调(P<0.05)。其中IL-6呈浓度依赖性,TNF-α不呈浓度依赖性。结论木犀草素可能通过下调p-STAT3抑制RAW264.7细胞致炎因子的表达,从而发挥抗炎作用。

慢性高糖抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞AKT磷酸化并促进其Ml型极化

目的研究慢性高糖对小鼠巨噬细胞的影响及机制.方法以正常生长液和含(40、60)mmol/L葡萄糖的生长液培养小鼠RAW264.7巨噬细胞1、3、5、7 d,相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot法检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)和IL-1O蛋白水平,ELISA检测培养细胞上清液IL-Iβ和IL,-10分泌量;实时定量PCR法检测细胞蛋白激酶B(AKT)mRNA水平,Western blot法检测细胞AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)蛋白水平.结果60 mmol/L葡萄糖处理1 d即出现较多长梭形细胞,可见伸展的伪足,且随时间延长数量增加、体积变大;处理1 d即明显抑制细胞增殖,随时间延长抑制效果有所改善;处理3,5,7d后,IL-1β蛋白水平增加、IL-10蛋白水平降低;处理1 d后IL-1β分泌显著增加,但处理3d后IL-10分泌显著减少且随时间延长进一步减少;处理3,5,7 d后,AKT蛋白磷酸化被抑制,但AKT mRNA水平未见明显变化.40 mmol/L葡萄糖处理在一定程度上发挥作用,但不如60 mmol/L葡萄糖显著和稳定.结论长期高糖刺激诱导巨噬细胞向促炎性M1型转变,诱发巨噬细胞的持续慢性炎症反应,其机制可能与抑制AKT蛋白磷酸化激活有关.

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

不同剂量异鼠李素对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响及其机制探讨

目的观察异鼠李素(ISO)对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264. 7增殖能力的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期RAW264. 7细胞,将细胞分为5组,低、中、高剂量组分别加入已经配好含10 ng/m L脂多糖(LPS)及低、中、高剂量ISO(50、100、200μg/m L)的溶液,模型组加入含10μg/m L LPS的1640培养基(含10%FBS),对照组加入含10%溶剂对照的1640完全培养基。测算各组细胞增殖指数,检测各组一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)。结果与对照组比较,模型组细胞12、24、36、48 h细胞增殖指数增加(P均<0. 05);与模型组比较,低剂量组24、36 h及中剂量组和高剂量组12、24、36、48 h细胞增殖指数减少(P均<0. 05);与低剂量组比较,中剂量组24 h及高剂量组24、48 h细胞增殖指数减少(P均<0. 05)。与对照组比较,模型组NO、TNF-α水平升高(P均<0. 05);与模型组比较,低剂量组NO水平及中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均<0. 05);与低剂量组比较,中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均<0. 05)。结论 ISO可抑制RAW 264. 7细胞增殖能力,且呈剂量依赖性,高剂量作用最大;机制可能与抑制NO、TNF-α有关。