基于UHPLC-Q-TOF/MS技术分析肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分

目的筛选肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分。方法(1)以人巨核细胞白血病细胞(Dami)与人骨髓基质细胞(HS-5)共培养的方式建立巨核细胞分化障碍模型作为评价体系,实验分组:Dami组(Dami)、对照组(Dami+HS-5)、PMA组[Dami+HS-5+5 ng·mL-1佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)]、模型组[Dami+HS-5+1%兔抗大鼠血小板血清(APS)+5 ng·mL-1PMA],培养48 h。采用流式细胞术检测巨核细胞分化成熟表面标记分子CD41a、CD61的表达情况。(2)将49只SD雄性大鼠随机分为空白血浆组、15 min组、30 min组、60 min组、90 min组、120 min组、240 min组,每组7只。各给药组大鼠灌胃肿节风总黄酮提取物1.26 g·kg^(-1),在6个设定时间点(15、30、60、90、120、240 min)采血制备肿节风总黄酮提取物经时含药血浆。(3)采用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MS)对肿节风总黄酮提取物经时含药血浆进行分析,以峰面积构建肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵(X矩阵)。将所采集的6个不同时间点的肿节风总黄酮经时含药血浆对巨核细胞分化成熟障碍模型进行干预,采用流式细胞术检测细胞表面分子CD41a、CD61的表达水平,构建肿节风总黄酮提取物经时含药血浆效应矩阵(Y矩阵)。(4)将X矩阵和Y矩阵数据标准化处理后,采用偏最小二乘法(Partial least squares,PLS)计算分析量效关系,以变量重要性投影(Variable importance for projection,VIP)>1为阈值,筛选与细胞表面分子CD41a、CD61变化相关的效应成分,并进行化学成分鉴定,作为肿节风总黄酮提取物中促进巨核细胞分化的潜在效应成分,最后回归评价体系验证其药效。结果(1)与Dami组比较,对照组Dami细胞表面的CD41a表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组比较,PMA组Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著升高(P<0.01)。与PMA组比较,模型组Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著降低(P<0.01)。(2)与空白血浆组比较,15、30、60、90、120、240 min各时间点Dami细胞表面分子CD41a、CD61表达水平均显著升高(P<0.01),且CD41a、CD61均在30 min组表达水平最高。在正、负离子模式下筛选出VIP值>1的潜在效应成分,并选取540.3638@12.25与559.2991@11.53两个成分进行药效学验证。559.2991@11.53被鉴定为胡萝卜苷(Daucosterol,Dau),540.3638@12.25被鉴定为迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖(Rosmarinic acid 4-O-β-Dglucoside,Ros)。Ros、Dau分别干预巨核细胞分化成熟障碍模型后,与模型组比较,Ros及Dau低、中、高剂量组(40、60、80μg·mL-1)的Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论Ros、Dau可能是肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分。

无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究

脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是一大难题 ,目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关 ,而将部分脐血进行巨核系祖细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径 ,但适用于临床应用的扩增条件至今仍未确立。本课题采用人脐血单个核细胞 (MNC)在无血清培养体系中使用TPO ,IL 3,SCF ,IL 6等细胞因子进行不同的组合 ,在培养的 0 ,6 ,10 ,14天进行MNC、CD4 1+细胞及CFU MK数的检测 ,以寻找最佳的细胞因子组合及最佳的收获时机。结果表明 :无血清条件下TPO与IL 3,SCF ,IL 6等细胞因子联用可实现脐血巨核系祖细胞有效的体外扩增 ,各因子组中以TPO +IL 3+SCF +IL 6组扩增效果为最佳 ,其CFU MK数于第 10天最多 ,扩增达 6 .8倍 ,CD4 1+细胞扩增达 8.8倍。结论 :在人脐血MNC无血清培养条件下 ,TPO +IL 3+SCF +IL 6组为巨核系祖细胞体外扩增较佳的因子组合。由于TPO +IL 3+SCF +IL 6组的CFU MK数于第 10天最多 ,CD4 1+细胞数亦为同期最高 ,故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第

系统性红斑狼疮血小板减少患者巨核祖细胞分化障碍

目的 明确系统性红斑狼疮 (SLE)血小板减少患者骨髓巨核祖细胞增殖分化情况 ,以及患者血清对巨核祖细胞增殖分化的影响。方法 分离 7例SLE血小板减少患者 (SLE血小板减少组 )、11例胸外科开胸手术切除肋骨患者 (正常对照组 )和 4例SLE血小板正常但病情活动患者 (SLE血小板正常组 )的骨髓单个核细胞 ,体外巨核祖细胞 (CFU MK)无血清半固体培养 ;并分别加入SLE血小板减少和SLE血小板正常患者的血清 ,观察血清对CFU MK集落形成的影响。结果 SLE血小板减少组CFU MK集落数为 (2 7.33± 9.30 )个 /片 ,明显低于正常对照组的 (6 1.2 2± 2 9.71)个 /片和SLE血小板正常组的 (6 0 .0 0± 2 9.71)个 /片 (P值均 <0 .0 5 ) ;加入SLE血小板减少患者血清后 ,SLE血小板减少组 (n =7)和正常对照组 (n =7)CFU MK集落数分别减少为(14 .2 9± 6 .73)和 (2 9.4 4± 2 3.35 )个 /片 (P <0 .0 5 )。加入SLE血小板正常患者血清后 ,正常对照组 (n =7)CFU MK增加到 (115 .6 0± 72 .99)个 /片 ,与未加血清者的差异无显著性 (P <0 .0 5 ) ;而SLE血小板减少组 (n =7)无显著增加 (P >0 .0 5 )。结论 SLE血小板减少患者骨髓巨核祖细胞分化障碍 。

骨髓内皮细胞条件培养液对巨核系细胞体外增殖的影响

目的 :探讨骨髓内皮细胞条件培养液 (E CM)对巨核系细胞体外增殖的调节作用。方法 :分离纯化骨髓内皮细胞和骨髓成纤维细胞 ,分别收集其无血清条件培养液 ,比较两种无血清条件培养液对体外扩增成熟巨核细胞和巨核系祖细胞的作用。结果 :E CM和骨髓成纤维细胞条件培养液 (F CM )对成熟巨核细胞及巨核系祖细胞有体外扩增作用 ;E CM对巨核系祖细胞的扩增作用明显优于F CM (P <0 .0 5 ) ;对成熟巨核细胞的扩增作用弱于F CM(P <0 .0 1 )。结论 :E CM对巨核系细胞 。

干细胞生长因子协同血小板生成素体外扩增脐血巨核前体细胞的研究

目的探讨在干细胞生长因子(SCF)和血小板生成素(TPO)组合作用下,人脐血CD34^+细胞体外扩增为巨核前体细胞的效果。方法采用经免疫磁珠纯化系统收集的人脐血CD34^+细胞与SCF+TPO组合体外培养,研究该组合对巨核前体细胞的扩增效果。结果在SCF和TPO组合的作用下,脐血CD34^+细胞(6例)显著地向巨核前体细胞(CD61+CD41^+细胞)扩增。CD61^+CD41^+细胞构成比在培养第7天达到峰值(15．57±4．95)％,第14天为(9．06±2．72)％；存第14天,CD61^-CD41^+细胞总数和巨核系细胞集落形成单位(CFU- MK)达到高峰,为较理想的培养时间。经过体外扩增,总细胞数、CD34^+细胞数、CD61^+CD41^+细胞和CFU-MK均显著增加。结论在SCF和TPO组合的作用下,脐血CD34^+细胞可有效地扩增为巨核前体细胞。

重组血小板生成素对再生障碍性贫血患者巨核祖细胞的作用

应用重组血小板生成素(rTpo)对17例再生障碍性贫血(AA)患者进行CFU-MK和CFU-GM培养。研究结果表明:①Tpo 10ng/ml为CFU-MK培养的最佳浓度;②AA患者CFU-GM和CFU-MK增殖均明显低于正常人,P<0.001;③AA患者CFU-MK增殖较CFU-GM更低(CFU-MKx 3.2,CFU-GMx 17.5);④Tpo对骨髓小剂量照射后CFU-MK的增殖有促进恢复,对血小板的减少起到积极预防作用。

造血刺激因子对巨核细胞体外扩增的影响

目的:探讨造血刺激因子对巨核系成熟细胞体外扩增的影响。方法:将小鼠骨髓单个核细胞(BMNC)按(2,4,6,8,1 0)×1 05个/mL浓度加入半固体培养体系,体外培养巨核细胞集落形成单位(CFU-M eg),观察BMNC数与CFU-M eg生成数之间的关系;将BMNC分别加入含rmSCF+rmTPO+rm IL-3(3HSFs),rmSCF+rm IL-3+rmTPO+rm IL-6(4HSFs)或骨髓成纤维细胞条件培养液(F-CM)的液体培养体系中持续培养,从培养的第1 d开始每两天观察巨核系成熟细胞的生成情况。结果:当小鼠骨髓单个核细胞按(2,4,6,8,1 0)×1 05个/mL浓度种入CFU-M eg培养体系时,CFU-M eg生成数随细胞种入数增加而增多;种入细胞浓度对CFU-M eg产率有影响,种入细胞浓度为1×1 06个/mL时,与种入细胞浓度为2×1 05个/mL,每2×1 05个骨髓单个核细胞生成的CFU-M eg数相比,差异有统计学意义(P<0.0 5)。3HSFs,4HSFs和F-CM均对巨核系成熟细胞体外扩增有促进作用。3HSFs和4HSFs的扩增作用明显优于F-CM,4HSFs的扩增效果优于3HSFs;3HSFs和4HSFs扩增体系扩增7 d效果最好,F-CM扩增体系扩增5 d效果最好。结论:3HSFs,4HSFs和F-CM均对巨核系成熟细胞体外扩增有促进作用;4HSFs扩增成熟巨核细胞效果优于3HSFs和F-CM;不同扩增体系扩增巨核细胞的最佳效果所需的时间不同。

血小板生成素和白细胞介素-11对慢性特发性血小板减少性紫癜巨核细胞的影响

目的 探讨重组人血小板生成素 (rh TPO)及联用重组人白细胞介素 - 11(rh IL - 11)对慢性特发性血小板减少性紫瘢 (CITP)患者骨髓巨核祖细胞增殖和成熟的影响。方法 采用血浆凝块法对 2 1例 CITP患者骨髓巨核祖细胞进行体外培养 ,培养体系中加入不同浓度的 rh TPO,或同时加 rh IL - 11两者联用。培养 14天后经 SZ-2 1(GP a)单抗和 ABC试剂盒染色观察集落生长数 ,用 MCDS- 2 0 10型超清晰度骨髓细胞分析系统进行巨核细胞的面积和直径测定。结果 CITP组骨髓巨核细胞面积及直径明显低于对照组 (P<0 .0 5 )。 rh TPO对 CITP患者的巨核细胞集落形成单位 (CFU - MK)总集落数、巨核细胞直径与面积均有促进作用 ,但无浓度依赖性。体外最适浓度为 10 ng/ ml;rh TPO与 rh IL - 11联用组较单用组的 CFU - MK、总集落数及面积、直径均显著增加。结论 CITP患者骨髓巨核细胞存在成熟障碍 ,体外 rh TPO单用及与 rh IL - 11联用均可促进 CITP患者巨核祖细胞的增殖与成熟 。

调控巨核系造血的细胞因子和转录因子(英文)

本文综述有关细胞因子和转录因子在调控巨核细胞和血小板生成的作用。巨核细胞的生成包括巨核系祖细胞增殖与分化为未成熟巨核细胞 ,再进一步分化为成熟巨核细胞并释出血小板的过程。在巨核系造血的早期阶段 ,主要由TPO及IL 1 ,IL 3和PDGF调控 ;在分化的后期有TPO及IL 6和IL 1 1参与。多个转录因子也参与巨核细胞的分化过程。GATA 1 ,FOG 1和Fli 1主要作为早期至中期巨核细胞生成的调节因子。NF E2则主要参与晚期巨核细胞分化和血小板生成的调控。目前对血小板释放的机制还缺乏深入了解。一氧化氮可能通过引起巨核细胞的凋亡 。

当归多糖在体外抑制HCMV感染所致巨核系细胞凋亡中的作用探讨

本研究探讨当归多糖(angelica polysaccharide,APS)在体外抑制HCMV感染致人巨核系细胞凋亡中的作用。HCMV AD169体外感染巨核系细胞CHRF-288-11,在病毒感染后第3天向试验体系中加入APS。用PCR扩增检测HCMV DNA,用形态学、DNA片段化、细胞表面标志检测APS对HCMV感染所致巨核系细胞凋亡的影响。结果表明:APS在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞CHRF-288-11凋亡,且呈剂量依赖性。感染的巨核系细胞CHRF-288-11中有hCMV IEA的表达,形态学和DNA片段化分析证实了细胞凋亡的存在,AnnexinV/PI双染流式细胞仪分析显示受感染的CHRF细胞中随着加入APS剂量的减少,凋亡率呈上升趋势。结论:HC-MV AD169株在体外可直接感染巨核系细胞并降低其存活率;HCMV AD169株在体外感染巨核系细胞后可诱导其加重凋亡,凋亡率与时间呈正相关。在HCMV AD169株体外感染巨核系细胞后,向培养细胞中加入APS,可以提高受染细胞的存活率,表明APS对HCMV感染的巨核系细胞有一定的保护作用;APS在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞凋亡,且呈剂量依赖性。

脐血巨核祖细胞的体外扩增

目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34+细胞定向扩增巨核祖细胞。方法采用免疫磁珠法(M ACS)分选CD34+细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-M K)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34+、CD41a+、CD61+、CD34+CD41a+和CD41a+CD61+)的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能。结果单用TPO7d时,CD34+CD41a+细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO+IL-11+肝素组扩增倍数为TPO组、TPO+IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P<0.05)。TPO+IL-11+肝素组巨核祖细胞中大集落(>50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO+IL-11组均有明显增加(P<0.05)。将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率。电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板。

巨核对暖云降水影响的模拟研究

利用耦合了新的暖云参数化方案的中尺度模式（MM5）,研究了暖云降水中巨核的作用。在这个暖云方案里,先假定一个三模态的气溶胶正态对数分布,然后考虑对流、扩散、云滴和雨滴的核化（非核化）过程,再由气溶胶质量的预报量显式地计算出气溶胶的数浓度。选择了华北地区2005年6月25~26日的一次弱冷锋过程,并以此研究了巨核对云和降水的影响。研究表明,巨核具有增强雨滴的凝结、碰并和云雨自动转化过程的作用,使得云滴数减少高达40%,云水减少达20%,云滴有效半径增加高达30%左右。在污染和清洁环境下巨核均可增加降水。

系统性红斑狼疮重症血小板减少患者血清对巨核祖细胞的影响

研究系统性红斑狼疮(SLE)合并重症血小板患者的血清对正常人巨核祖细胞增殖分化的影响。以12例SLE重症血小板减少患者为研究对象,12份正常骨髓单个核细胞,培养中分别加入患者血清或灭活补体的患者血清,免疫化学染色检测巨核细胞克隆形成单位(CFU-MK),流式细胞仪检测CD41+细胞数。结果是正常对照组骨髓CFU-MK集落数为(61.22±29.71)个/片,加入SLE重症血小板减少患者血清后减少为(29.44±23.35)个/片,P<0.05;加灭活补体血清后减少为(22.56±15.21)个/片,与正常对照相比P<0.05;灭活补体与否差异不显著,P>0.05。加入患者血清或灭活补体的血清后,CD41+细胞数由正常(2.30%±1.63%)分别减少为(1.15%±0.85%)和(1.07%±0.76%),与正常对照相比P<0.05;灭活补体与否差异不显著。SLE血小板正常但活动期病人的血清对正常人CFU-MK和CD41+细胞的生成均无显著抑制。提示SLE重症血小板减少患者血清能抑制正常人骨髓巨核祖细胞的增殖分化,这种抑制作用是非补体依赖性的。

体外构建人巨核祖细胞/胃癌细胞融合体生成血小板的研究

目的构建脐血巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体产生功能性血小板。方法免疫磁珠分选人脐带血CD34+细胞,通过RPMI1640培养基体外静态培养,加入定向分化因子TPO、FL、IL-3、IL-6产生巨核祖细胞;复苏胃癌SGC7901细胞;采用聚乙二醇(PEG)化学融合法制备巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体,HAT筛选系统分选融合细胞,继续培养;流式细胞仪检测培养孔上层液中类血小板颗粒表面CD41、CD62p表达,血小板聚集试验、粘附试验检测血小板功能,瑞氏染色观察颗粒形态。结果免疫磁珠分选的CD34+细胞培养7 d可增殖80倍,与胃癌SGC7901细胞株经PEG化学融合法融合成巨核祖细胞/胃癌细胞,融合率为(36.91±1.08)%;融合细胞培养10 d可增殖4倍,产生(6.1±1.21)×106/ml的类血小板颗粒;瑞氏染色后观察,其形态与正常血小板相似。类血小板颗粒表达血小板特异性标志CD41及血小板活化后标志CD62p,与正常血小板比较,CD62p在类血小板颗粒中表达略降低:正常血小板(74.11±1.71)%、类血小板颗粒(71.04±1.64)%;CD41表达明显降低:正常血小板(88.83±3.26)%、类血小板颗粒(72.51±2.79)%(t=6.59,P<0.05);聚集试验表明具有正常血小板相似的聚集功能;血小板粘附试验:正常血小板(40.43±1.63%)、类血小板颗粒(35.53±4.06%)。结论通过PEG细胞化学融合法构建的脐带血巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体能产生功能性血小板。

Ⅱ型登革病毒对人骨髓巨核祖细胞集落生长的影响

采用人骨髓巨核祖细胞体外半固体培养技术,观察14例次Ⅱ型登革病毒(D_2V)对巨核祖细胞集落(CFU-MK)生长的影响,与对照组进行比较,显示D_2感染组CFU-MK产率明显减少,经统计学处理差别有非常显著意义,从而证实在体外D_2V能抑制巨核祖细胞增殖。这提示登革出血热病人的出血和血小板减少与巨核细胞受该病毒抑制有关。

干扰素对特发性血小板减少性紫癜患者骨髓巨核祖细胞的影响

为观察重组干扰素 α２ａ（ｒ Ｉ Ｆ Ｎ α２ａ）对 Ｃ Ｉ Ｔ Ｐ患者慢性特发性血小板减少性紫癜（ Ｃ Ｉ Ｔ Ｐ）患者骨髓巨核祖细胞增殖和成熟的影响，采用血浆凝块法培养３３例巨核祖细胞，经 Ｓ Ｚ２１单克隆抗体和 Ａ Ｂ Ｃ试剂盒染色后计数其集落，用图象分析仪测定巨核细胞的直径、面积和黑度值，并与２５例健康人（对照组）比较。结果： Ｃ Ｉ Ｔ Ｐ组患者的巨核祖细胞面积和直径均低于对照组，但集落数正常；ｒ Ｉ Ｆ Ｎ α２ａ 在体外对患者巨核祖细胞集落生成抑制率明显低于对照组；对患者骨髓涂片，巨核细胞数增高组巨核祖细胞集落抑制率明显低于巨核细胞数正常组。结果表明，ｒ Ｉ Ｆ Ｎ α２ａ 在体外对 Ｃ Ｉ Ｔ Ｐ患者巨核祖细胞增殖的抑制作用较正常对照组弱；用ｒ Ｉ Ｆ Ｎα２ａ 治疗 Ｃ Ｉ Ｔ

1，25（OH）_2D_3及其类似物调节人原始巨核白血病细胞系增殖分化的机制

１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３及其两种新型类似物（ＭＣ９０３和ＥＢ１０８９）对人原始巨核白血病细胞系ＨＩＭｅｇ的增殖分化过程有重要调节作用。本研究利用分子杂交及逆转录－聚合酶链反应首次证明，ＨＩＭｅｇ细胞中有１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３受体（ＶＤＲ）ｍＲＮＡ的表达，强烈提示１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３对ＨＩＭｅｇ细胞的作用是由ＶＤＲ介导的。同时还发现，１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３及其类似物、维甲酸在调节ＨＩＭｅｇ细胞增殖分化过程中，Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达水平迅速降低，６ｈ时已基本达到最低水平，提示这些作用因子对ＨＩＭｅｇ细胞的抑制增殖和诱导分化作用是和Ｃ－ｍｙｃ癌基因的表达改变密切相关的。

人巨细胞病毒对脐血巨核系祖细胞集落生长的影响

目的 :探讨人巨细胞病毒 (HCMV)对巨核系祖细胞 (CFU - MK)的分化和增殖的影响。方法 :收集 2 0例脐血标本 ,采用体外甲基纤维素半固体培养技术 ,观察 3种不同浓度 HCMV AD16 9株对 CFU - MK集落形成的影响。结果 :3个感染组的 CFU - MK集落数均减少 ,与灭活病毒组比较 ,分别为 2 4.0 %、35 .8%和 48.6 % (P <0 .0 5 ) ,显示抑制程度与病毒感染滴度呈剂量 -浓度依赖关系。结论 :HCMV在体外能抑制 CFU - MK的分化和增殖 ,提示巨细胞病毒感染引起的血小板减少与 CFU - MK受该病毒抑制有关。

原始巨核白血病细胞系(HI-Meg)诱导前后sis和mye癌基因表达的研究

我们对巨核细胞分化与癌基因表达的关系进行了初步研究。HI-Meg为原始巨核白血病细胞系,经维甲酸诱导后,该细胞向成熟巨核细胞方向分化。我们检测了C-myc及C-sis两种癌基因在诱导前后的HI-Meg细胞中mRNA表达的改变。结果表明,在诱导后的巨核细胞中,sis表达下降3.82倍,myc表达下降4.54倍,但这两个癌基因表达仍高于在正常淋巴细胞中的水平。本文讨论了这一结果对研究巨核细胞分化与调控及白血病发生的意义。