去除IgG的系统性红斑狼疮血小板减少血清对脐带血巨核细胞克隆形成单位生成的影响

目的:研究去除IgG的系统性红斑狼疮(SLE)合并血小板减少患者的血清,对正常脐带血巨核细胞克隆形成单位(CFU-MK)生成的影响。方法:建立正常人脐带血单个核细胞在血小板生成素(TPO)等作用下,向CFU-MK分化的半固体培养体系;亲和层析去除SLE血小板减少患者血清中的IgG组分并加入培养体系,研究干预前后CFU-MK集落形成的数量和形态学差异。结果:正常脐带血(n=10)CFU-MK集落数为(69.3±19.4)个/片,多为中～大集落;加入SLE血小板减少患者血清(n=4)后,集落数为(58.5±32.5)个/片,与正常相比变化相近(P>0.05),但其中一例患者减少为29个/片;去除血清IgG组分后(n=4),CFU-MK为(73.0±28.3)个/片,与正常相比变化相近(P>0.05);其中一例加入血清后减少为35个/片,去除IgG后仍为31个/片,CFU-MK生成抑制未解除。形态学上,加患者血清后大集落数由正常对照的(37.4±10.9)个/片显著减少为(9.0±8.8)个/片(P<0.05);去除IgG后,大集落数亦显著减少为(8.3±3.9)个/片(P<0.05)。而加入患者血清或去除IgG后,小集落相对数量比正常对照显著增多(P<0.05)。结论:SLE血小板减少患者血清中可能存在阻碍CFU-MK分化发育的抑制物,这种抑制物可能不依赖于血清IgG组分。

苯和二甲苯对骨髓成纤维细胞克隆形成单位（CFU－F）的联合作用

本实验用苯和二甲苯在３０ｍｇ／ｋｇ和６０ｍｇ／ｋｇ两个浓度下对近交系ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行腹腔注射染毒。结果发现，经一周连续腹腔注射染毒，在两个浓度下苯染毒组骨髓ＣＦＵ－Ｆ均显著减少，且有明确的剂量反应关系。而二甲苯染毒组没有显著变化，苯、二甲苯联合染毒组也没有显著变化。该实验提示苯对骨髓ＣＦＵ－Ｆ有抑制作用，而在苯和二甲苯联合染毒时，该抑制作用又表现得不明显，故作者认为两者对ＣＦＵ－Ｆ的联合作用是相减的。

造血刺激因子对巨核细胞体外扩增的影响

目的:探讨造血刺激因子对巨核系成熟细胞体外扩增的影响。方法:将小鼠骨髓单个核细胞(BMNC)按(2,4,6,8,1 0)×1 05个/mL浓度加入半固体培养体系,体外培养巨核细胞集落形成单位(CFU-M eg),观察BMNC数与CFU-M eg生成数之间的关系;将BMNC分别加入含rmSCF+rmTPO+rm IL-3(3HSFs),rmSCF+rm IL-3+rmTPO+rm IL-6(4HSFs)或骨髓成纤维细胞条件培养液(F-CM)的液体培养体系中持续培养,从培养的第1 d开始每两天观察巨核系成熟细胞的生成情况。结果:当小鼠骨髓单个核细胞按(2,4,6,8,1 0)×1 05个/mL浓度种入CFU-M eg培养体系时,CFU-M eg生成数随细胞种入数增加而增多;种入细胞浓度对CFU-M eg产率有影响,种入细胞浓度为1×1 06个/mL时,与种入细胞浓度为2×1 05个/mL,每2×1 05个骨髓单个核细胞生成的CFU-M eg数相比,差异有统计学意义(P<0.0 5)。3HSFs,4HSFs和F-CM均对巨核系成熟细胞体外扩增有促进作用。3HSFs和4HSFs的扩增作用明显优于F-CM,4HSFs的扩增效果优于3HSFs;3HSFs和4HSFs扩增体系扩增7 d效果最好,F-CM扩增体系扩增5 d效果最好。结论:3HSFs,4HSFs和F-CM均对巨核系成熟细胞体外扩增有促进作用;4HSFs扩增成熟巨核细胞效果优于3HSFs和F-CM;不同扩增体系扩增巨核细胞的最佳效果所需的时间不同。

PDGF-BB促粒细胞/巨核细胞生长及其作用机制的研究

目的:探讨血小板衍生生长因子(PDGF-BB)对体外粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的生成作用及其对人巨核细胞株CHRF抗凋亡作用的具体机制。方法:采用血浆凝固培养法培养小鼠和人骨髓细胞CFU-GM和CFU-MK,探讨PDGF-BB对两者CFU-GM、CFU-MK形成能力的影响。通过AnnexinV/PI双染、活性Caspase-3表达及JC-1线粒体膜势能流式细胞术检测研究PDGF-BB对人巨核细胞株CHRF的抗凋亡作用机制。结果:PDGF-BB 0-100 ng/ml能够促进小鼠/人CFU-GM和CFU-MK的增殖并呈剂量依赖性,其中50 ng/ml作用最为明显(P<0.01)。流式细胞术检测结果表明,PDGF-BB通过线粒体及Caspase-3通路对人巨核细胞株CHRF发挥抗凋亡作用(P<0.05)。结论:PDGF-BB能够促进体外小鼠和人粒-单核系及巨核系造血生成,且能通过线粒体途径和Caspase-3通路对巨核细胞发挥抗凋亡作用。

四种重组造血生长因子对小鼠巨核细胞集落的影响

小鼠体外巨核系祖细胞培养表明,重组鼠白细胞介素-3(IL-3),粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素-6(IL-6)及红细胞生成素(EPO)均有不同程度刺激巨核系祖细胞生长的活性。其最适浓度分别为100U/ml,5ng/ml,20ng/ml与1U/ml。对巨核细胞集落刺激作用最强的是IL-3,IL-6与GM-CSF次之,EPO最弱。在种植2×10~5骨髓单个核细胞中分别获得45±3,25±2,20±3及10±2个巨核细胞集落。

恶性淋巴瘤自体骨髓移植后重组体粒细胞—巨噬细胞克隆刺激因子的治疗作用

自体骨髓移植(ABMT)已成为治疗复发性淋巴瘤的一种标准疗法,但有5～15％的病人发生致命性的并发症。大多数ABMT者全血细胞减少达3～4周,可导致严重疾病,平均住院期40～50天。重组体人类粒细胞—巨噬细胞克隆刺激因子(rhGM-CSF)是一种调节性糖蛋白,可促进骨髓细胞存活、增殖和成熟,增强成熟中性白细胞和单核细胞的功能。美国波士顿、奥马哈、西雅图的三所癌症研究中心和医疗中心对128名恶性淋巴瘤ABMT病人进行前瞻性的随机、双盲和安慰剂对照研究。研究组(治疗组)65人,男41人,女24人,平均年龄37.0±12.6岁(8～60岁),其中急淋8例,非何杰金氏淋巴瘤45例,何杰金氏病11例;治疗药物为rhGM-CSF250mg/M^2.d(每毫克含5×10~7克隆形成单位),用50ml生理盐水和0.1％的人血清白蛋白混合。对照组(安慰剂组)63人,男47人,女16人,

AMD3100对apoE^-/-小鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖、迁移和黏附的影响

探讨AMD3100对apoE-/-小鼠骨髓内皮祖细胞的动员作用及其增殖、迁移和黏附的影响.12只8周龄雄性apoE-/-小鼠随机分为AMD3100组(2.5mg/(kg·2d))和对照组(PBS0.1ml/2d),高脂高胆固醇饲料喂养12周后,差速贴壁法结合微孔法分离培养小鼠骨髓细胞,免疫荧光鉴定CD133/VEGFR-2双阳性细胞为内皮祖细胞;MTT比色法、Transwell、黏附试验分别检测细胞的增殖、迁移和黏附能力;通过计数典型内皮祖细胞克隆形成单位,观察次级集落单位的大小及细胞密度,检测各组内皮祖细胞的克隆形成能力;RT-PCR和Westernblot检测内皮祖细胞上CXCR4mRNA和蛋白质表达水平.与对照组比较,AMD3100组骨髓源性内皮祖细胞的增殖、迁移、黏附和克隆形成能力均显著低于对照组,其CXCR4mRNA和蛋白质表达均显著低于对照组.结果表明:持续注射AMD3100可抑制骨髓源内皮祖细胞的增殖、迁移、黏附和克隆形成能力,并下调CXCR4的表达.

胚胎干细胞微环境增强人角膜缘干细胞的干性和抑制凋亡的机制

背景 成体干细胞的命运与其生存的微环境密切相关.研究表明,胚胎干细胞（ESCs）微环境能增强人角膜缘干细胞（LSCs）的干性,其作用机制是研究热点. 目的 探讨干细胞微环境增强LSCs的干性及其抑制细胞凋亡的分子机制.方法将129小鼠ES细胞株（E14细胞）分别用CnT-20培养液和CnT-20＋体积分数20％ ES（ESC-CM）培养液进行培养和传代.采用新鲜供体人角膜缘组织块培养法,分别用CnT-20培养液和ESC-CM培养液培养和传代LSCs,细胞经固定后于光学显微镜下观察细胞克隆形态并计算克隆形成率（CFE）.ESC-CM培养组细胞分别转染端粒酶逆转录酶（TERT） siRNA（19-25nt siRNA）或siRNA（sc37007）,流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡、线粒体膜电位的改变;采用免疫荧光技术和流式细胞技术检测siRNA转染前后细胞中端粒酶的表达和活性氧簇（ROS）的产生情况;采用RT-PCR、免疫荧光技术和Western blot法检测细胞中干细胞标志物p63、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）、整合素β1（integrin β1）和细胞分化标志物细胞角蛋白3（CK3） mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot法检测细胞中黏着斑激酶（FAK）、Akt和糖原合成酶激酶3β（GSK3β）及其磷酸化蛋白以及p21蛋白的改变. 结果 ESC-CM培养组LSCs可传至第8代,CFE为（7.6±0.6）％,CnT-20培养组传至第6代,CFE为（5.6±0.6）％,差异有统计学意义（t=4.454,P=0.011）;ESC-CM培养组第2、3、4、5、6代LSCs的凋亡百分比均明显低于CnT-20培养组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;siRNA-F转染细胞的凋亡率为（7.7±1.3）％,明显低于siRNA-TERT转染细胞的（32.3±3.1）％,差异有统计学意义（t=-12.588,P=0.000）.ESC-CM培养组与CnT-20培养组的原代LSCs 中干细胞标志物mRNA及其蛋白、TERT蛋白的相对表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05）,但ESC-CM培养组CK3 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于CnT-20培养组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;ESCCM培养组第2代细胞中干细胞标志物蛋白及TERT蛋白表达量均明显高于CnT-20培养组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.siRNA-TERT转染组细胞端粒酶活性为（4.83±0.67）％,明显低于siRNA-F转染组的（46.71±1.22）％,差异有统计学意义（t=52.116,P=0.000）.ESC-CM培养组培养液中添加了FAK抑制剂和GSK3β抑制剂以及转染TERT-siRNA后,细胞中pFAK、pAkt、pGSK3β的表达明显减弱,而p21的表达增强.ESC-CM培养组第2代LSCs及siRNA-F转染组细胞的线粒体膜电位明显高于CnT-20培养组和siRNA-TERT 转染组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;ESC-CM培养组原代和第2代细胞中及siRNA-F转染组细胞中ROS表达比例均明显低于CnT-20培养组及siRNA-TERT转染组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）. 结论 ESC-CM培养体系可促进LSCs干性的维持,抑制细胞凋亡,其机制可能与端粒酶-p21-线粒体通路及FAK/Wnt 信号通路的激活有关.

基因治疗中高效表达逆病毒的包装细胞系建立及其影响因素

高效稳定表达逆病毒颗粒的包装细胞系的建立是逆病毒载体介导的基因治疗中关键步骤,是决定基因治疗成败的关键因素[‘’.尽管未来将有越来越多的携带有目的基因的逆病毒载体借该技术进人临床匕],但目前对其应用中技术指标进行系统报道较少.为指导相关技术的临床应用,我们对其建立过程及其影响因素进行厂系统的比较性研究.

Graves病粒细胞减少患者骨髓CFU-GM生长的研究

目的 :体外研究Graves病 (GD)患者骨髓CFU -GM的生长情况。方法 :11名正常对照 ,16名GD患者(11名为白细胞减少 ,5名为粒细胞缺乏 ) ,进行外周血检测 ,骨髓检查和CFU -GM的体外培养。结果 :GD粒细胞缺乏患者CFU -GM体外生成率显著低于正常对照组 ,而白细胞减少组患者CFU -GM的生成率与对照组比较无显著差异。结论 :GD患者出现白细胞减少时 ,虽然外周血中白细胞数目和粒细胞比例已明显降低 ,但处于这一时期的患者骨髓尚有一定的代偿能力。在粒细胞缺乏阶段 ,骨髓功能受到严重影响 ,CFU -GM明显减少。

特发性血小板减少性紫癜骨髓造血干细胞的功能及与疗效的关系

目的:探讨特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP)患者骨髓造血干细胞的增殖分化功能,并从巨核细胞集落形成单位的数量和血小板上升的幅度探讨两者之间的疗效关系。方法:用甲基纤维素半固体培养ITP患者粒-巨噬细胞集落形成单位、红系集落形成单位、巨核细胞集落形成单位,观察巨核细胞集落形成单位与血小板上升平均值的关系。结果:ITP患者骨髓粒-巨噬细胞集落、红系集落形成单位、巨核细胞集落形成单位集落数低于正常对照组,粒-巨噬细胞集落数及丛落数高于正常对照组,巨核细胞数大于5/高倍视野的ITP患者其巨核细胞数与血小板上升无关,巨核细胞集落形成单位与血小板上升平均值有关。结论:ITP患者骨髓造血干细胞增殖分化功能异常,提示ITP可能是造血干细胞异常的疾病。ITP的巨核细胞集落形成单位与血小板上升幅度有关,巨核细胞集落形成单位可以预测ITP的治疗效果。

体外负压培养对小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力和血管内皮生长因子分泌水平的影响

背景:如何增强骨髓间充质干细胞增殖活性使其移植后发挥应有的疗效是目前急需解决的问题。目的:探讨体外负压培养技术对小鼠骨髓间充质干细胞增殖活性及血管内皮生长因子分泌水平的影响。方法:取第3代骨髓间充质干细胞,给予间歇性负压培养(-6.65,-13.3,-26.6kPa),2h/次,1次/12h,对照组在正常条件下培养。培养12,24,36,48,60h,采用CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA检测细胞分泌血管内皮生长因子水平,RT-PCR检测血管内皮生长因子受体mRNA表达。根据上述结果,选择一个最佳负压条件和时间(-26.6kPa,24h),将骨髓间充质干细胞分为正常对照组、负压组、负压+血管内皮生长因子受体抑制剂Axitinib组,CCK-8法检测细胞增殖情况,EDU试剂盒检测EDU细胞阳性率,结晶紫染色观察细胞集落形成单位。结果与结论:①与对照组比较,3个负压干预组骨髓间充质干细胞显著增殖(P<0.05);②与对照组比较,3个负压干预组细胞分泌血管内皮生长因子水平显著增高(P<0.05),血管内皮生长因子受体mRNA表达显著增高(P<0.05);③经血管内皮生长因子受体抑制剂处理后,细胞增殖吸光度值、克隆形成单位数量及EDU阳性细胞率较负压干预组明显降低;④结果表明,体外负压培养可能通过上调血管内皮生长因子分泌水平促进骨髓间充质干细胞增殖。

补肾中药诱导干预骨髓间充质干细胞成骨分化研究进展

干细胞是一种具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能的细胞。骨髓组织中有两种干细胞，即造血干细胞和骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSCs），后者早期称为克隆形成单位成纤维细胞（colony—forming—unitsfibroblasts，CFU—F）或骨髓基质细胞（bonemarrowstromalcells，BMSCs）。BMSCs在体外的概念是指能够快速贴壁，容易克隆和持续扩增的骨髓来源的细胞。BMSCs在一定的条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等。近几年来利用中药制剂诱导骨髓间充质细胞定向分化的成骨细胞移植治疗骨缺损导致的骨不连和延迟愈合以及股骨头坏死等疾病受到了广泛的关注，成为临床和实验研究的热点之一。

胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性及化疗药物耐受细胞的生物学机制

背景:氟尿嘧啶是胃癌化疗的基础药物,临床上耐药现象较为常见。肿瘤干细胞对化疗药敏感性较低,可能是导致化疗后肿瘤复发进展的重要原因。目的:探讨胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性,从细胞生物学角度分析胃癌的化疗耐药机制。方法:利用免疫组织化学染色法检测69例胃癌组织内干细胞标志物CD44和耐药蛋白胸苷酸合成酶表达情况;基于克隆形态的分选策略,从AGS胃癌细胞系内分离胃癌干细胞克隆,检测CD44和胸苷酸合成酶的表达和自我更新能力;利用CCK-8法检测不同AGS细胞克隆的5-氟尿嘧啶半数抑制浓度(IC50)。结果与结论:69例胃癌组织标本中,胸苷酸合成酶和CD44的表达阳性率分别为57%(39/69)和61%(42/69),CD44与胸苷酸合成酶的表达之间呈正相关关系(Kappa=0.41,χ2=11.59,P<0.05)。AGS细胞系的克隆形成率为39%(29/69),其中,副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为17%(5/29)、69%(20/29)、14%(4/29)。二代克隆形成后,采用胰酶消化克隆并再次低密度接种传代,副克隆均无法传代,次克隆仅少数可连续传代,全克隆均可连续传代。不同浓度5-氟尿嘧啶作用之后,全克隆的生长抑制率均显著低于次克隆和AGS细胞,经比较差异均有显著性意义(P<0.05)。以上结果表明胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶敏感性较低,其对化疗药物耐受,可能是临床胃癌化疗耐药的产生机制之一。

Amgen的干细胞因子开始人体实验

Amgen Inc.(Thousand Oaks,CA)发明的重组人干细胞因子(SCF)最近开始了乳腺癌Ⅰ期人体试验和两个独立的淋巴瘤和乳腺癌病人的Ⅰ/Ⅱ期试验。 Indiana大学医疗中心(Indianapolis,IN)的临床研究员说,当给晚期乳腺癌患者结合化疗施用该因子时,增加了骨髓和外周血中的循环性中性白细胞和先祖细胞的数目。 在试验中,给8位病人皮下注射了10、25或50μg/kg/天的SCF,共14天。施用后,作为干细胞标志的CD34细胞数增加了2.4倍;集落形成单位提高了近9倍且突发形成单位巨核细胞增加了2.3倍。

免疫抑制剂环胞素A对鼠骨代谢的生物学效应

目的探讨实验条件下免疫抑制剂环胞素A(CsA)在骨代谢过程中对破骨细胞和成骨细胞克隆的生物作用及其机制。方法用不同浓度的环胞素A与鼠骨髓细胞共同培养,诱导产生破骨细胞和成骨细胞克隆。分别以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检查破骨细胞,碱性磷酸酶(ALP)染色检查CFU-F克隆和Von’Kassol染色检查CFU-OB克隆;光镜下计数破骨细胞数、CFU-F和CFU-OB成骨细胞克隆数。结果实验条件下环胞素A可诱导鼠破骨细胞的数量显著增加(F=16.496,P<0.001),且破骨细胞的数量与环胞素A剂量呈线性正相关(r=0.579,P<0.05);成骨细胞克隆CFU-F和CFU-OB的数量变化与环胞素A无相关性(F=1.380,F=0.305,P>0.05)。结论环胞素A在实验条件下可诱导鼠破骨细胞数量的增加,但对成骨细胞克隆无显著影响,环胞素A对骨代谢的生物作用可能是通过上调破骨细胞系统从而导致生物体发生骨质疏松。

原发性血小板增多症伴脑梗死16例临床分析

原发性血小板增多症（ET）是一种以骨髓巨核细胞持续增生和血小板增多为特征的慢性骨髓增生性疾病，属于髓系克隆性疾病。主要临床表现为出血、血栓形成倾向及脾肿大。以脑梗死为首发表现者临床少见且极易造成误诊和漏诊。因而提高对原发性血小板增多症引起脑血管病的认识，尽早诊断、及时治疗，具有重要的临床意义。