人巨细胞病毒UL123基因全长及其外显子4的克隆与表达

【目的】克隆人巨细胞病毒（HCMV）UL123基因cDNA全长（iel）及其外显子4（iel-exon4），构建原核表达重组质粒，诱导立即早期蛋白1（IE1）及其C-端86-491氨基酸（IE1-C86-491）表达，并鉴定表达产物。【方法】分别用RT-PCR和PCR法将iel和iel-exon 4从感染了HCMV的人胚肺成纤维细胞（HEL）中扩增出来，再分别克隆入原核表达载体pTWIN1上intein2的N端，转化大肠杆菌，经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子，在低温和低IPTG浓度下诱导重组子表达可溶性重组融合蛋白rIE1／intein2和rIE1-C86-491／intein2，用SDS-PAGE和Western Blotting对表达产物进行鉴定。【结果】经PCR、限制性酶切和测序鉴定重组质粒pTWIN1／iel和pTWIN1／iel-exon4构建成功，sDS-PAGE和Western Blotting分析表明融合蛋白在大肠杆菌中表达。【结论】成功克隆并表达了iel和iel-exon4。

先天性心脏病与弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒感染的关系

目的探讨先天性心脏病(先心病)与弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)及单纯疱疹病毒(HSV)感染的关系。方法选取80例先心病患者(先心病组)和32例非先心病者(对照组)。采用聚合酶链反应(PCR)荧光定量方法检测两组受检者心肌组织、血清和白细胞中的TOX、RV、CMV及HSV4种基因并进行比较。结果先心病组心肌组织中TOX、RV、CMV、HSV的基因检出率分别为16.2%、18.8%、28.8%和7.5%,对照组分别为0、0、18.8%和6.2%,两组TOX、RV基因检出率间差异有统计学意义(P<0.05),CMV、HSV基因检出率间差异无统计学意义(P>0.05)。先心病组与对照组心肌组织中CMV、HSV阳性者的CMV〔(5.50±1.30)copies/ml和(5.30±0.33)copies/ml〕、HSV〔(4.51±0.87)copies/ml和(4.32±0.17)copies/ml〕基因定量比较,差异均无统计学意义(P>0.05);先心病组与对照组白细胞中CMV阳性者的CMV〔(5.23±1.20)cop-ies/ml和(5.02±0.79)copies/ml〕基因定量比较,差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论先心病的发生与TOX、RV、CMV、HSV感染有关,但与病原体感染的数量无关。

人类巨细胞病毒感染对脐血造血祖细胞增殖的影响(英文)

目的探讨人类巨细胞病毒(HCMV)感染对脐血造血祖细胞(CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Mix及CFU-Mk)体外增殖的抑制作用及其机制。方法20例脐血标本收集于正常足月顺产新生儿。实验共分5组:(1)3个HCMV感染组,每个感染组分别加入0.1 mL的103、104及105空斑形成单位(PFU)HCMV-AD169病毒液于培养体系中;(2)灭活对照组,加入同体积灭活HCMV病毒液;(3)空白对照组,不加HCMV病毒液,代之以同体积的IMDM。采用造血祖细胞体外半固体培养技术,培养、观察、计数HCMV-AD169株对脐血CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Mix及CFU-Mk集落数、抑制率和集落维持时间;并用聚合酶链反应(PCR)技术检测集落细胞内HCMV-DNA。结果(1)在造血祖细胞培养体系中加入不同滴度的HCMV-AD169后,104和105PFU滴度感染对CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Mix及CFU-Mk集落形成均有显著的抑制作用,103PFU滴度感染对CFU-Mix及CFU-Mk集落形成有显著的抑制作用,与空白对照组和灭活对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。病毒滴度越高,抑制程度越明显(P<0.05)。(2)104和105PFU滴度感染组CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Mix及CFU-Mk集落维持时间较对照组明显缩短(P<0.01),103PFU滴度感染组CFU-Mix和CFU-Mk集落维持时间较对照组明显缩短(P<0.01)。(3)PCR显示3个感染组的CFU-GM、CFU-E、CFU-Mix及CFU-Mk集落细胞内均有HCMV-AD169DNA存在。结论HCMV-AD169能直接感染CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Mix及CFU-Mk造血祖细胞,并抑制造血祖细胞的增殖,这可能与HCMV感染患儿出现粒细胞减少、血小板减少和贫血等造血功能紊乱有关。

巨细胞病毒感染对定向干细胞增殖的影响及黄芪的干预作用

目的:探讨巨细胞病毒(CMV)感染对定向干细胞(CFU-Gm、CFU-E、BFU-E、CFU-Mk及CFU-TL)体外增殖抑制的影响及黄芪的干预作用。方法:采用造血细胞培养技术,培养、观察、计数CMV-AD169感染CFU-Gm、CFU-E、BFU-E、CFU-Mk及CFU-TL后各祖细胞集落及维持时间;用聚合酶链反应(PCR)和荧光定量PCR技术检测集落细胞内CMV-AD169DNA;根据细胞毒性实验结果,将黄芪作用于CMV感染的CFU-Gm、CFU-E、BFU-E、CFU-Mk及CFU-TL祖细胞,再分别计数集落、峰期及维持时间。结果:(1)CMV感染组CFU-Gm、CFU-E、BFU-E、CFU-Mk及CFU-TL集落数较对照组明显减少(P<0.01);集落维持时间CMV感染组较对照组明显缩短;(2)用PCR在感染组集落细胞内检测到HCMV-DNA的存在;(3)黄芪作用于CMV感染的定向干细胞后,与病毒组比较集落数明显提高(P<0.01),集落增殖提高率分别为CFU-GM27.2%;CFU-E45.2%;BFU-E49.1%;CFU-Mk11.9%,CFE-TL55.2%,且集落维持时间明显延长;(4)荧光定量PCR技术检测集落细胞内CMV-DNA复制较CMV感染组明显减少(P<0.01)。结论:CMV-AD169株在体外能明显抑制CFU-Gm、CFU-E、BFU-E、CFU-Mk及CFU-TL集落细胞的增殖;在体外黄芪有明显抗CMV作用,能促进CMV感染的定向干细胞增殖。

高迁移率族蛋白B1在小鼠巨细胞病毒感染小鼠内耳中的表达

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box chromosomal protein 1,HMGB-1)在小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染导致听力损失发病机制中的作用。方法:采用新生小鼠颅内注射病毒法建立MCMV感染动物模型,测定2周龄小鼠的听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR),采用RT-PCR检测耳蜗组织HMGB-1mRNA表达,均与注射生理盐水的对照组比较。结果:ABR,病毒组(28.42±3.03)dB,对照组(15.66±0.38)dB(t=3.042,P<0.01)。HMGB-1mRNA,病毒组2.372±0.193,对照组0.754±0.322(t=7.537,P<0.01)。结论:HMGB-1可能通过维持并加重内耳的迟发性炎症,成为巨细胞病毒感染导致听力损失发生发展的病理基础。

人巨细胞病毒感染致造血祖细胞增殖抑制与更昔洛韦的影响(英文)

背景:临床研究显示,骨髓移植后人巨细胞病毒感染可阻碍血小板植入、出现表型异常的外周血白细胞,导致骨髓移植失败,这可能是由于人巨细胞病毒感染直接影响了造血祖细胞所致。目的:观察更昔洛韦对人巨细胞病毒感染所致脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞体外增殖抑制的影响及更昔洛韦对此的保护作用。设计:对比观察性实验。单位:泸州医学院附属医院分子生物学实验室。对象:正常足月顺产新生儿脐血标本20例,每份10mL,由泸州医学院附属医院妇产科提供,产妇对本实验知情同意。实验经医院伦理委员会批准。方法:实验于2004-06/2006-12在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成。采用脐血标本造血祖细胞培养技术,观察、计数100TCID50人巨细胞病毒-AD169感染粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞后各祖细胞集落数,记录集落维持时间。用PCR和荧光定量PCR技术检测集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。将7.5mg/L更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的造血祖细胞,再分别计集落数、集落维持时间及集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。设正常培养的造血祖细胞为空白对照组,设与含灭活性人巨细胞病毒的正常造血祖细胞培养系统为灭活对照组。主要观察指标:①祖细胞集落数、祖细胞集落维持时间。②祖细胞集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。结果:①集落数和集落维持时间:人巨细胞病毒感染的祖细胞集落数较对照组明显减少(P<0.01),集落维持时间较对照组明显缩短(P<0.01)。在人巨细胞病毒感染的集落细胞内检测到人巨细胞病毒-DNA的存在;更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的祖细胞后,与人巨细胞病毒感染的祖细胞比较集落数明显提高,差异有非常显著性意义(P<0.01),集落维持时间明显延长,差异有非常显著性意义(P<0.05)。②集落增殖提高率:粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞、巨核系祖细胞分别为37.4%,74.2%,40.1%,67.4%,38.9%。③集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA:荧光定量PCR显示更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的祖细胞后核酸载量较人巨细胞病毒感染的祖细胞降低,差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:人巨细胞病毒-AD169株在体外能明显抑制粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞集落细胞的增殖;在体外更昔洛韦有抗人巨细胞病毒的活性,能促进人巨细胞病毒感染的造血祖细胞增殖。

巨细胞病毒DNA含量及T淋巴细胞亚群变化与抽动障碍发病的关系

目的 检测抽动障碍患儿巨细胞病毒DNA含量及T淋巴细胞亚群的临床意义。方法 采用荧光基因定量检测法分别对 101例抽动障碍患儿和 34例健康对照组儿童进行血清HCMV基因定量检测,并用间接免疫荧光染色法分别测定两组儿童外周血T淋巴细胞亚群。结果 抽动障碍患儿血清中HCMV检出率(36. 6% )显著高于正常对照组(2. 9% ) ( 2 =14. 07, P<0. 01),外周血CD4+、CD4+ /CD8+[ (36. 71±4. 67)%, (106. 76±19. 23)% ]较正常对照组 [ ( 40. 24±2. 51 )%, ( 131. 57±37. 69 )% ]显著降低,而CD8+ [ (35. 28±3. 96)% ]较对照组 [ ( 30. 63±7. 52 )% ]显著升高 (P<0. 01 )。抽动障碍患儿中HCMV阳性组CD8+ [ (37. 84±6. 93)% ]与阴性组[ (31. 45±6. 28)% ]比较显著升高,CD4+ /CD8+阳性组[ (90. 78±10. 76)% ]比阴性组[ (112. 76±14. 60)% ]显著降低(P<0. 01),而CD3+、CD4+两组间比较无显著差异(P>0. 05)。结论 HCMV感染可能是引起抽动障碍的一个重要原因。抽动障碍患儿存在明显的细胞免疫功能紊乱,表现为T淋巴细胞亚群平衡失调,提示细胞免疫功能紊乱可能与某些儿童易感HC MV及易患抽动障碍有关。

既往健康成人巨细胞病毒性重型肝炎的临床分析

目的 :分析巨细胞病毒性重型肝炎的临床特点。方法 :采用酶联免疫吸附实验及聚合酶链反应对 5例巨细胞病毒性重型肝炎的病原学进行检测 ,定期检测其肝功能、三大常规、凝血酶原时间、肝脏B超等 ,同时观察临床症状、体征的变化。结果 :5例巨细胞病毒性重型肝炎的临床表现特点为急性起病、发热、黄疸进行性加深和严重的肝功能损害 ,在病程 3～ 4周时 ,病情急剧变化 ,预后极差。结论 :巨细胞病毒也是病毒性肝炎的致病因子之一 。

肾移植受者巨细胞病毒感染与抗心磷脂抗体的关系

目的 探讨肾移植受者巨细胞病毒 (cy-tomegalovirus,CMV)感染与抗心磷脂抗体 (anticardiolipinantibody,ACA)产生的关系 .方法 肾移植受者 146例术后采用定性聚合酶链反应法 (PCR)检测 CMV- DNA,同时用酶联免疫吸附法 (EL ISA )检测血清抗心磷脂抗体免疫球蛋白 G(ACA- Ig G) ,并与正常对照组 (n=32 )进行比较 .结果 肾移植受者 146例 ACA阳性率为 17.1%,与正常对照 (6 .3%)无明显差异 ;而 CMV感染的肾移植受者 ACA阳性率为31.2 %,显著高于未感染 CMV的受者 (7.1%)及正常对照组(6 .3%,P<0 .0 1) .结论 肾移植受者 ACA的产生与 CMV感染密切相关 ,可能是 CMV导致移植肾慢性血管病变的原因之一 .

人巨细胞病毒pp150基因的原核表达及抗原性分析

①目的 构建人巨细胞病毒 (HCMV) pp15 0的原核高效表达系统 ,制备用于急性、活动性HCMV感染血清学诊断的基因工程抗原。②方法 PCR扩增HCMVpp15 0抗原决定簇 (84 0～ 10 4 8aa)编码基因片段 ,分别插入原核表达载体 pMAL p2、pET 2 8a ,转化宿主菌E .coli.诱导表达 ,经麦芽糖亲和层析树脂纯化 ,以Western Blot及间接ELISA法鉴定其抗原性。③结果 重组表达质粒 pMAL p2 pp15 0可在E .coli.DH5α中有效表达 ,表达产物经SDS PAGE电泳后 ,凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为 6 .4万 ,约占菌体蛋白的 10 %。而重组质粒pET 2 8a pp15 0未见明显表达带。Western Blot检测 ,阳性识别率为 80 % (12 / 15 )。用此蛋白包被ELISA板 ,检测正常孕妇血清 ,阳性率为 6 .5 % (17/ 2 6 3)。与本室制备的全病毒抗原ELISA的诊断符合率为 96 %。④结论此重组蛋白具有良好的抗原性 ,进一步完善后可用于HCMV急性和活动性感染的诊断。

PCR法与荧光定量PCR法在人巨细胞病毒检测中的作用比较

目的比较常规PCR法与荧光定量PCR(FQ-PCR)法在人巨细胞病毒(HCMV)检测中的作用,寻找更适合于HCMV检测的方法。方法构建携带CMV-DNA的标准质粒,利用常规PCR技术及FQ-PCR技术分别对不同稀释度的标准质粒进行检测。结果FQ-PCR法对HCMV标准质粒检测的灵敏度及线性范围均显著高于常规PCR法。结论FQ-PCR法比常规PCR法更适合HCMV病毒的检测。

器官移植受者外周血中人巨细胞病毒pp67-mRNA的RT-PCR检测

目的:探讨使用RT-PCR的方法对人巨细胞病毒pp67-mRNA检测的可行性。方法:对38例肾移植受者的外周血样本共68份分别进行免疫荧光技术检测pp65抗原和RT-PCR技术检测人巨细胞病毒pp67-mRNA。结果:在7例受者外周血中的13份外周血样本中检出pp65抗原阳性,并有1例诊断为HCMV病;在3例受者外周血中的3份外周血样本中检出pp67-mRNA阳性,其中包括2例受者的2份样本pp65抗原同时检出为阳性并有1例诊断为CMV病。结论:pp65抗原和pp67-mRNA检测结果不具有同一性,不能使用pp67-mRNA检测取代pp65抗原的检测。使用RT-PCR可以对人巨细胞病毒pp67-mRNA作出定性的判断。

人巨细胞病毒对细胞周期调控靶点-P^(53)的影响

目的了解HCMV对细胞周期调控靶点P53的影响。方法建立体外HCMV感染人胚肺成纤维细胞(HEL)模型,(1)倒置显微镜观察不同时间下各组HEL的病变效应。(2)S-P免疫组化法检测P53蛋白的表达。(3)FQ-PCR法检测HEL细胞内HCMVDNA拷贝数。结果(1)HCMV感染使HEL细胞发生病变,细胞内HCMVDNA拷贝数随时间的延长逐渐增加。(2)S-P免疫组化结果提示HCMV感染使HEL细胞P53蛋白的水平升高。结论HCMV的感染改变了细胞内P53的水平,可能影响其在细胞周期中的正常功能,营造有利于病毒复制的环境。

人巨细胞病毒抑制粒-单及红系祖细胞的体外增殖及干预研究

探讨人巨细胞病毒 (HCMV)抑制脐血粒 -单系祖细胞的 (CFU GM)、红系爆式祖细胞 (BFU E)及红系祖细胞 (CFU E)的体外增殖和黄芪注射液与更昔洛韦(GCV)对此的干预作用 ,采用造血祖细胞体外培养、聚合酶链反应 (PCR)技术 ,培养、观察、计数CFU GM、BFU E及CFU E集落产率、抑制率、提高率 ,集落峰值时间和集落维持时间 ,并用PCR检测集落细胞内HCMV DNA。结果显示 :①HCMVAD169对CFU GM、BFU E及CFU E均有抑制作用 ,其抑制作用与HCMV浓度有关 ,高浓度 ( 1∶1 0 ,1 1 0 0 )感染组与对照组比较集落产率明显下降 (P <0 0 1 ) ,集落维持的时间明显缩短 (P <0 0 1 ) ,集落峰值时间无明显差异 (P >0 0 5) ,而低浓度组 ( 1∶1 0 0 0 )无此作用 ;②PCR检测发现在HCMV感染的造血祖细胞内存在HCMV DNA ;③在 1∶1 0感染组中 ,加入黄芪注射液与更昔洛韦后 ,HCMVAD169感染的CFU GM、BFU E及CFU E集落产率明显增加 (P <0 0 1 )。结论 :①造血祖细胞是HCMVAD169的宿主细胞之一 ,HCMVAD169能直接感染造血祖细胞 ;②在体外HCMVAD169对CFU GM、BFU E、CFU E的生长 ,集落形成有明显的抑制作用 ;③黄芪与更昔洛韦有抗HCMV作用 。

人巨细胞病毒对粒-单及红系祖细胞体外增殖的影响

目的 :探讨人巨细胞病毒 (HCMV)对脐血粒 单系祖细胞 (CFU GM )、红系爆式祖细胞 (BFU E)及红系祖细胞 (CFU E)体外增殖的抑制作用。方法 :采用造血祖细胞体外半固体培养技术 ,研究HCMV AD16 9株对脐血CFU GM、BFU E及CFU E集落生长的影响 ;用聚合酶链反应 (PCR)技术检测集落细胞中HCMV AD16 9DNA。结果 :①HCMV AD16 9对CFU GM、BFU E及CFU E均有抑制作用。②其抑制作用与HCMV浓度有关 ,高浓度 (1∶10 ,1∶10 0 )感染组与对照组比较集落产率明显下降 (P <0 .0 1) ,集落维持的时间明显缩短 (P <0 .0 1) ,而低浓度组 (1∶10 0 0 )无此作用。③经PCR检测发现病毒感染组CFU GM、BFU E及CFU E集落细胞中有HCMV AD16 9DNA存在。结论 :①HCMV AD16 9可抑制CFU GM、BFU E及CFU E集落的生长。②造血祖细胞是HCMV AD16 9的宿主细胞之一 ,HCMV AD16 9能直接感染造血祖细胞。

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的 :探讨多重半巢式聚合酶链反应 ( msn PCR)在研究巨细胞病毒 ( CMV) DNA多聚酶基因 ( UL -54)中的应用价值。方法 :从 8例心肺移植患者血标本中提取 DNA,以 CMV-UL 54为模板 ,自行设计 6条特异性引物 ,建立 msn PCR扩增系统。扩增产物在 DNA测序仪上自动测序。结果 :msn PCR能扩增出 42 7bp和 1 0 52 bp两条目的片段 ,扩增产物测序表明存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论 :msn PCR扩增结合测序 ,可检测 CMV-UL 54的 7个功能区目片段中的碱基突变 ,msn PCR比普通 PCR更加省时和经济。

反义硫代寡核苷酸对小鼠巨细胞病毒性心肌炎心肌组织iNOS表达的影响

目的:探讨反义硫代寡核苷酸(AODN)对小鼠巨细胞病毒性心肌炎心肌组织iNOS表达的影响。方法:应用无病原体的Balb/C小鼠120只,随机分为6组,每组20只,其中正常对照和病毒对照各1组,4个实验组。正常对照组小鼠腹腔内注射0.1mlDMEM液,其它5组小鼠腹腔内接种0.1ml含TCID5010-4MCMV的DMEM液,半小时后4个实验组小鼠腹腔内注射0.2ml不同剂量的AODN,正常对照组和病毒对照组分别注射0.2mlAODN媒体溶液。实验第7d测定心肌酶谱(CK、CK-MB、GOT、LDH和LDH1/LDH2)活性,并且进行了心肌组织病理学、免疫组化和Westernblot检查。结果:随注射AODN剂量增加,心肌炎发病率逐渐降低;心肌细胞变性、坏死及间质炎性细胞浸润程度逐渐减轻;CK、CK-MB、GOT、LDH和LDH1/LDH2活性逐渐降低;心肌组织iNOS蛋白表达逐渐下降。结论:AODN抑制病毒的复制可能与抑制心肌组织iNOS蛋白的表达有关。

幼儿园儿童巨细胞病毒分离毒株的限制性酶切图谱分析

目的 调查幼儿园学龄前儿童间人巨细胞病毒 (HCMV)传播的分子流行病学状况。②方法 应用限制性核酸内切酶 ,对 112名幼儿园儿童尿标本分离到的部分HCMV毒株进行酶切图谱分析。③结果 自 2所幼儿园同组儿童分离到的大多数HCMV毒株具有相同的限制性酶切图谱。④结论 水平传播是幼儿园婴幼儿间HCMV传播的主要方式 。

造血干细胞移植后人巨细胞病毒动态监测的临床意义

【目的】探讨造血干细胞移植(HSCT)术后巨细胞病毒(CMV)感染的监测方法及意义。【方法】对40例进行HSCT的患者采用实时聚合酶链反应(PCR)技术定量动态监测白细胞中巨细胞病毒(CMV)DNA载量并进行比较分析。【结果】40例进行HSCT的患者中有12例出现阳性,阳性率为30.00%。1例死亡,病死率为2.50%。12例阳性患者均经CMV抗病毒治疗,其中1例死亡,11例转阴。阳性结果持续次数最长为21 d,最短为7 d。【结论】动态监测巨细胞病毒感染状况在移植群体中有着重要的价值。