转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。

巨霸杨组培再生体系的建立及潮霉素抗性试验

以巨霸杨为试材，采用不同植物激素组合及潮霉素不同浓度梯度筛选法，研究了巨霸杨组培再生体系建立及潮霉素对叶片和茎尖苗生长分化的影响。结果表明：诱导叶片芽分化的最佳培养基为MS4-6-BA0．25mg／L＋IBA0．1mg／L，再生芽在1／2MS＋IBA0．3mg／L上生根形成完整植株。通过对无菌苗叶片和茎尖材料不同浓度梯度潮霉素抗性筛选试验，发现潮霉素（Hygromycin）对巨霸杨产生了较为敏感的选择压力，随着培养天数的增加潮霉素的抑制作用越来越明显。同茎尖苗比，叶片对潮霉素更为敏感。叶片培养2d后即有明显受损表现，茎尖苗在培养4d后才出现损伤。14d后，在4mg／L潮霉素条件下只有个别叶片在叶柄基部有少量芽分化；6mg／L以上潮霉素条件下叶片及茎尖苗则全部失绿死亡。经过对比，确定巨霸杨的潮霉素筛选临界浓度范围为4～6mg／L。该研究为巨霸杨的基因转化奠定了技术基础。