中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术构建中华绒螯蟹卵巢两个发育时期的差减cDNA文库。正向差减杂交以Ⅲ期卵巢为试验方、Ⅱ期卵巢为驱动方 ,反向差减杂交以Ⅱ期卵巢为试验方、Ⅲ期卵巢为驱动方 ;将所获差减cDNA片段克隆入质粒表达载体 ,转化大肠杆菌JM 10 9。最后获得的正、反向差减文库分别含 86 3、 36 0个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段平均大小分别为 36 0和 16 0bp 。

人参植物与皂苷生物合成相关的差减cDNA文库构建及基因差异表达分析

应用抑制差减杂交技术,分别以源于4年和1年生人参根组织cDNA群体作为检测子(tester)与驱赶子(driver),成功构建了与人参植物皂苷生物合成相关的差减cDNA文库,并对从中筛选的阳性cDNA克隆进行DNA测序及其序列分析、PCR及Northern印迹杂交鉴定.结果显示,获得的13个克隆为新基因序列.其中6个差减克隆系人参植物根生长发育阶段差异表达基因.目前,6个差异表达新基因的结构与功能仍在进一步研究中.

施氏鲟精巢和卵巢差减cDNA文库的构建和差异表达EST的筛选

应用抑制差减杂交(SSH)技术构建了施氏鲟(Acipenser schrenckii)精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cD-NA差减文库,从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测,随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,68个片段与已报道的基因有较高的同源性,其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因,而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子(EF-1)和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因,而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细胞发育成熟相关的基因。这些EST数据为进一步筛选和克隆鲟鱼性腺组织特异性表达基因提供了材料平台,为鲟鱼基因组数据增补了大量信息。[中国水产科学,2006,13(1):8-12]

文昌鱼性腺差减cDNA文库的构建

本研究以日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA为材料,应用抑制性差减杂交技术构建文昌鱼雌雄性腺的差减cDNA文库。正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方,反向差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方,将所获差减cDNA片段克隆插入质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含459、243个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段,其中90%左右的克隆皆能扩增出有效产物,插入片段范围为200-600bp,符合差减文库PCR产物片段的大小。随机选取30个阳性克隆测序分析,得到26有效基因片段,进一步从中选取16个序列,用实时定量PCR对文库质量进行验证,结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺差异表达基因的目的。文昌鱼性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定性腺分化和发育相关基因奠定了基础。

应用抑制性差减杂交技术构建铁皮石斛差减cDNA文库的探讨

[目的]探讨构建铁皮石斛抑制差减文库的方法,为克隆石斛碱生物合成相关功能基因奠定基础。[方法]采用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别以4年生和1年生铁皮石斛叶片互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为检测子(tester)与驱赶子(driver),将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(PointTMXa-1T-Vector),转化大肠杆菌JM109,聚合酶链反应(PCR)扩增鉴定插入片段。[结果]成功地构建了与石斛碱生物合成相关的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含560、220个重组子;插入片段的平均大小为550bp。[结论]所构建的差减cDNA文库适合进一步克隆分析石斛碱相关功能基因研究。

经前期综合征肝气逆证猕猴脑组织差减cDNA文库的构建

构建经前期综合征(PMS)肝气逆证猕猴与正常猕猴大脑边缘系统正向与反向差减文库,并对猕猴cDNA文库进行了系统测序和分析,以期筛选出与PMS肝气逆证相关的基因,尤其是与PMS肝气逆证有关的一些神经递质、性激素受体的基因。差减文库构建成功,为弄清PMS肝气逆证差异表达基因奠定了基础。

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减cDNA文库,以期筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver),经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。

富集小麦磷胁迫响应基因的cDNA差减文库构建和部分ESTs的功能鉴定

植物在形态学和生化代谢水平上对低磷胁迫逆境的响应，是特异表达基因在时空上精细协同作用的结果。以前期工作中鉴定的磷高效小麦品种石新828为材料，构建了富集不同低磷处理时间点特异表达基因的根系cDNA差减抑制杂交文库。获得的克隆总数为2682个。对随机选取的文库克隆研究发现，克隆中插入的片段长度为250．750bp。测序结果和功能比对发现，具有功能比对结果的克隆比例为70％，其中部分分别与小麦、大麦、水稻、玉米和拟南芥等植物种属高度同源，参与转录调控、蛋白质合成和代谢等多个生物学过程。该富集低磷胁迫响应基因文库为进一步鉴定小麦响应磷胁迫逆境的基因调控网络和克隆重要的磷高效相关基因奠定了坚实的基础。

两个标准化cDNA差减文库的构建

目的 构建 2个标准化 c DNA差减文库。方法 以淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性品系为Tester、敏感性品系为 Driver,进行正向抑制性差减杂交 ;以敏感品系为 Tester、抗性品系为 Driver,进行反向抑制性差减杂交。分别将获取的 2组抑制性差减杂交产物克隆入质粒表达载体 (Pin-Point TMXa- 1T- Vector) ,并以 PCR扩增鉴定插入片段。结果 获得 2个标准化 c DNA差减文库 ,其中抗性相关基因 (抗性品系高表达或特异表达 )文库含 5 2 3个重组子 ,敏感相关基因 (敏感品系高表达或特异表达 )文库含 2 86个重组子。插入片段大小平均约 36 0 bp。结论 所建的

骨质疏松骨组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的构建抑制差减文库,为克隆、筛选骨质疏松骨组织中失活或低表达的致骨质疏松相关基因奠定基础。方法分别从小鼠正常骨和骨质疏松骨组织分离mRNA,合成双链cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接。应用抑制性削减杂交(SSH)技术,分别以正常骨组织与骨质疏松小鼠cDNA作为检测子(tester)与驱赶子(driver),在通过两轮差减杂交和两次抑制性PCR得到两者之间的差异表达的cDNA,将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(PointTMXa-1T-Vector),转化大肠杆菌JM109,挑取克隆进行PCR扩增鉴定插入片段。结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含576、322个重组子;插入片段的平均大小为530bp。结论该差减cDNA文库的建立为进一步筛选、鉴定骨质疏松发生过程中的相关调控基因奠定了基础。

黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析

应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝（Monopterus albus）IV期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库。正向差减杂交以间期性腺为试验方,IV期卵巢为驱动方;反向差减杂交以IV期卵巢为试验方,间期性腺为驱动方。将获得的差减cDNA片段连接质粒载体,然后转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子。经PCR扩增鉴定插入片段范围为200-2 000 bp。随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析,得到90个有效基因片段,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对。进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR,对文库质量进行验证。结果表明,所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的。黄鳝性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础。

通过差减文库筛选山羊羔肠道淋巴集结特异表达基因

羊羔肠道淋巴集合淋巴结(Peyer’s patch,以下简称PP),是B淋巴细胞的主要来源地和发育、成熟场所,兼具中枢淋巴器官和周围淋巴器官的功能.采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法,构建山羊羔肠道淋巴集结与其非PP肠壁组织的差减cDNA文库,以期找到在山羊羔肠道淋巴集结中特异表达的与免疫相关的基因.分别从山羊羔PP与非PP肠壁组织提取总RNA,反转录成cDNA,以PP作为待检组织(tester),非PP肠壁作为驱动组织(driver),经过两轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了两种组织间差异表达基因的差减cDNA文库.对其中160个克隆测序,得到几个可能与免疫相关的基因,为进一步从中挑选和表达活性蛋白基因用于生产免疫增强剂奠定了基础.

通过差减文库筛选文昌鱼神经胚中特异表达的基因

目的:构建文昌鱼12 h神经胚与6 h原肠胚的差减cDNA文库,以期从中挑选出在神经、肌肉、体轴发育过程中特异表达的基因,以便对文昌鱼早期胚胎的发育调控机制进行进一步研究。方法:分别从文昌鱼12 h胚胎和6 h胚胎提取总RNA,反转录成cDNA,以文昌鱼12 h胚胎的cDNA作为tester,并以6 h胚胎的cDNA作为driver,经过两轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒DNA,EcoR I酶切鉴定插入片段,由此构建文昌鱼早期两个不同发育时期的差减cDNA文库。结果:对200个文库克隆进行了测序,筛选到一些可能在文昌鱼12 h神经胚中特异表达的基因。结论:成功构建了文昌鱼12 h/6 h胚胎差减cDNA文库,所获得的12 h神经胚中特异表达的基因,为进一步对文昌鱼早期发育调控机制进行研究提供了材料。

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。经典cDNA文库存在克隆的片段短等缺点,而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息,从而克隆cDNA全长;对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库,可以增加克隆低丰度mRNA的机会;差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义;改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主,介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。

甘蓝型油菜种子不同发育时期SSH文库的构建

利用抑制差减杂交技术构建了20d和35d甘蓝型油菜湘油15发育种子特异表达基因的SSH文库。随机挑取单菌落进行PCR表明,文库质量较好。在20d和35 d SSH文库中随机挑选489个阳性克隆进行测序,获得452条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行Blast比对及功能注释,比较20d和35 d SSH文库的基因表达谱,发现在20 d SSH库中参与糖代谢的基因出现频率较高,而在35 d SSH库中与脂肪酸储存有关的油体蛋白家族、与脂肪酸转运有关的柠檬酸合酶、与脂肪酸合成有关的酰基载体蛋白去饱和酶等,参与油脂代谢相关基因出现频率较高。该结果对进一步研究油菜脂肪酸代谢调控的分子机制打下了基础。

根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇(Rosamultiflora‘Inermis4’)的基因表达分析

多花蔷薇无刺4号(Rosamultiflora‘Inermis4’)对根癌病有较强抗性。以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接种多花蔷薇无刺4号为目的材料,刺伤处理为对照,采用抑制差减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法,构建了富集多花蔷薇根癌病抗性相关基因的差减cDNA文库。差异筛选差减cDNA文库后,随机选取增强表达的92个克隆进行测序,去除冗余的cDNA和病菌的基因片段,共得到53个单一序列。利用GenBank数据库进行核酸和蛋白质同源性比较,获得的cDNA片段功能涉及:细胞分裂、生长(22个克隆),逆境防御、信号转导及激素调节(11个克隆)以及初生与次生代谢(10个克隆)。另有10个基因片段功能未知,可能为新的EST。根据测序及比对分析结果,对多花蔷薇无刺4号抗根癌病的分子机理进行了探讨。

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufm1基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufm1基因,经全长cDNA文库筛选获得Ufm1基因全长序列。【结果】Ufm1基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9.3ku,等电点pI为6.55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufm1基因存在较高的同源性。【结论】Ufm1基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufm1基因功能及原核表达等奠定了基础。

经前期综合征肝气逆证猕猴模型边缘系统关键受体基因的差异表达

目的:研究经前期综合征(PMS)肝气逆证边缘系统关键受体基因表达差异,揭示该病证基因水平部分发病机制。方法:选取高地位猕猴运用择时挤压造模法制备PMS模型,运用抑制性消减杂交技术构建PMS肝气逆证猕猴与正常猕猴边缘系统正向与反向差减cDNA文库,运用该文库制备表达谱基因芯片进行差异表达基因研究。结果:在猕猴模型边缘系统中中枢单胺类神经递质受体5-羟色胺1A受体(5-HT1AR)、5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)mRNA表达均升高;γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)mRNA表达降低;中枢甾体激素受体雌二醇α受体(EαR)、雌二醇β受体(EβR)mRNA表达降低;孕酮受体(PGR)mRNA表达升高。结论:上述6个受体基因与PMS肝气逆证中枢发病机制关系密切。

长春花细胞C_(20)hi生物碱超量合成及激素自养的分子机制探讨

以长春花激素自养型细胞株C20hi及其母株C20D为材料,构建抑制性差减cDNA文库,斑点杂交筛选后对阳性克隆进行测序,共得到104个不同的差异表达基因片段。将这些序列在GenBank中进行BLAST比对分析,其中28个与已知基因具有很高的同源性。对部分基因的分析发现长春花细胞C20hi中g10h-like、CrPS(Catharanthus roseus protein S)、HyPRP(hybrid prolin-rich protein)、PNAE(polyneuridine aldehyde ester-ase)-like等基因的差异表达可能与该细胞株生物碱超量合成有关;而细胞色素P45071D和CR5基因的差异表达则可能与其激素自养有关。此外,培养基中2,4-D的缺失引起的TDC等酶活性的增强也可能是C20hi细胞生物碱超量合成及激素自养的原因之一。

氡染毒小鼠肺及支气管组织的基因表达

目的 构建氡染毒小鼠肺及支气管组织差异表达基因的cDNA文库，并对其进行初步鉴定和同源性分析。方法 采用SR—NIM02型氡室对小鼠进行吸人染毒后，常规饲养3个月，分别提取和纯化染毒组（30工作水平月，WI。M）与对照组（0．02WLM）小鼠的肺及支气管组织的总RNA，采用Super SMART技术和抑制性差减杂交技术（SSH），构建氡染毒后肺及支气管组织的正、反向差减杂交的cDNA文库；常规连接pGEM—T—easv载体，转化DH5α感受态细胞，巢式PCR鉴定；对阳性克隆测序，并与GeneBank数据库进行BLAST同源性比对，进行初步功能分类。结果共获得克隆460个，其中含有插入片段的克隆146个，经BLAST同源性比对后有48个正向差减cDNA片段与61个反向差减cDNA片段与GeneBank中的序列有不同程度的同源性。结论 成功构建了氡染毒小鼠肺支气管差异表达cDNA文库，染毒后小鼠肺及支气管组织中某些基因会发生差异表达，其中部分基因可能参与细胞凋亡和周期调控、机体免疫调节及细胞间信号传导等过程。