贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法分离纯化鉴定大鼠纤维环源干细胞

背景:目前,细胞疗法治疗椎间盘退变多以骨髓间充质干细胞为主。但是,使用骨髓间充质干细胞作为纤维环再生的种子细胞存在修复部位形成异位骨化和畸胎瘤的危险。因此,寻找一种新的纤维环组织工程种子细胞对椎间盘退变的治疗将具有巨大的经济和社会意义。目的:通过贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附筛选法分离纯化大鼠纤维环源干细胞,观察纯化效果及细胞的生物学特性。方法:从SD大鼠椎间盘中获取纤维环组织,机械-酶消化法获取原代纤维环源干细胞,通过贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法纯化纤维环源干细胞,在显微镜下观察细胞形态变化及增殖情况,应用细胞免疫荧光技术和qPCR技术检测干细胞表面标志物的表达,对筛选后的细胞进行多系诱导分化和特征性基因检测。结果与结论:①纯化后细胞生长良好,形态多以角形和星形多突起细胞为主,具有较好的增殖能力;②细胞膜表面抗原CD73、CD90、CD105呈阳性表达,CD45、CD34呈阴性表达;③经特定诱导后,细胞可以成功分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞;④成骨诱导后Collagen-Ⅰ、Runx2、成软骨诱导后Collagen-Ⅱ、Sox-9和成脂诱导后PPAR-γ、LPL各特征性基因均在细胞中呈高表达,与诱导前比较,差异有显著性意义(P<0.05);⑤结果表明,贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法能够有效筛选、纯化大鼠纤维环源干细胞,所得的细胞生物学性能良好,具有较好的增殖及多向分化潜能。

Fibronectin差别黏附法筛选、纯化软骨终板干细胞

目的通过Fibronectin介导进行差别黏附筛选软骨终板干细胞,观察筛选的效果及其初步生物学性能。方法从脊柱融合术中获取椎间盘软骨终板标本,机械-酶消化法获取原代软骨终板细胞,体外扩增至第2代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶,孵育20 min后将未贴壁细胞及培养液转移至新培养瓶再孵育40 min,吸弃未贴壁细胞及培养液,所得2瓶细胞进行体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面标志物。对筛选后的细胞进行向多系细胞诱导分化。结果第2代细胞筛选前,细胞形态个体差异较大,呈三角形或多角形,融合时呈铺路石样外观,筛选后细胞形态比较均匀,形成细胞克隆群。流式细胞仪检测发现:经Fibronectin筛选后所获软骨终板干细胞CD90、CD73表达阳性率>95%,CD105表达阳性率>85%;经诱导能向骨、软骨及脂肪细胞方向分化。结论 Fibronectin筛选所得的软骨终板细胞基本符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义标准。Fibronectin差别黏附筛选法得够有效筛选、纯化软骨终板干细胞。