用差异显示反转录PCR银染技术研究植物基因表达的差异

通过调整差异显示反转录PCR (DDRT PCR)中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量 ,优化了适用于银染检测的DDRT PCR方法 .PCR扩增产物经 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后 ,银染能检测到多而清晰的条带 .泳道中的条带数最少为 40个 ,最多达 80个 ,平均为 6 0个 ,条带大小分布在 10 0～ 90 0bp范围 ,灵敏度为 5pg/mm2 .此方法操作简便快速 ,灵敏度高 ,重复性好 .采用这个改良的方法 ,分析了拟南芥野生型和ast突变型基因表达的差异 .从 16 0 0 0个cDNA扩增产物条带中筛选出 2 8个差异条带 .二次PCR扩增后 ,进一步筛选出 13个差异条带 ,其中 7个是野生型特异表达的 ,6个是突变型特异表达的 。

苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。

差异显示反转录-PCR及抑制性扣除杂交在基因表达差异分析中的应用

差异显示反转录 -PCR和抑制性扣除杂交是目前广泛应用于基因表达差异分析的方法 ,它们分别具有灵敏度高假阳性率低等特点 ,对其原理、技术。

差异显示反转录PCR技术的建立和改进

本文对差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）的一系列条件进行了探索和改进，建立了有效的ＤＤＲＴ－ＰＣＲ方法。特别是单锚定碱基引物Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１２）Ｍ（Ｍ＝Ａ，Ｇ，Ｃ）的应用，不但得到了十分良好的实验结果，而且在很大程度上降低了实验成本和工作量。

反转录差异显示技术及其方法的改进

运用mRNA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况 ,为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理 ,优点与缺点 ,以及近年来对该技术涉及的RT PCR方法、引物设计、PCR反应参数、电泳及差异条带的显示方法以及杂交方式进行了论述和评价 ,并对其应用前景进行了简单分析。

mRNA差异显示技术的应用与改进

目的 :克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因。方法 :对mRNA差异显示PCR(DDRT PCR)的一系列条件进行了探索和改进 ,建立了有效的DDRT PCR法。结果 :在高、低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果 ,共获得 9个有显著差异的cDNA片段 ,测序后进行同源序列比较 ,有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源 ,还有一个可能是一个新基因的部分序列。结论 :通过对传统方法的改进 ,大大提高了工作效率 ,降低了实验成本和工作量并对相关问题进行了探讨 ,为进一步的研究奠定了基础。

人胎脑mRNA的差异显示分析及脑表达新ESTs的分离

应用mRNA差异显示技术分析人胎脑组织不同发育阶段及不同部位基因表达的差异并研究其特异表达的基因。以3个锚定引物Oligo（dT）12M（M=A，G，C）及20个随机引物，对脑组织mRNA进行了近50次差异显示分析，共分离出上百个差示产物。对其中部分产物进行克隆、测序获得了39个CDNA序列，长度为100～500bp。其中34个已被Genbank接受并给予新序列编号。

肝郁证模型大鼠海马内差异表达片段生物信息学分析

目的:通过对肝郁证模型大鼠的海马内差异表达片段的分析,探讨生物信息学在证候研究领域的应用。方法:对实验前期分离出的差异表达片段进行生物信息学分析。首先利用UniGene数据库进行ESTs聚类,使用软件对ESTs进行拼接,完成拼接之后,对重新组装的contig进行注释。结果:差异表达的1号片段与12号片段分别代表了GSK3b与St3gal5这两个基因转录产物;进一步将GSK3b与St3gal5的功能加以分析后,提示这两个基因产物可能与肝郁证的发生、发展相关。结论:海马是逍遥散调节慢性不可预知温和应激的重要作用部位,众多基因参与了逍遥散对慢性应激的调节,生物信息学方法在证候研究方面有重要的意义。

差异基因的高通量筛选研究

随着多个生物体全基因组序列的公布,研究重点更多地转移到基因功能分析上,基于生物品质改良、基因诊断及疾病治疗等考虑,分离并克隆生命体生长发育等过程的时空特异性差异表达基因也越来越受到关注。论文围绕近年来较具代表性的5种分析方法,即表达序列标签、差异显示反转录PCR、抑制消减杂交、基因表达系列分析和微阵列技术,分析各方法的原理及优缺点,以期对今后开展研究时的选择起到参考作用。

单眼视觉剥夺大鼠视皮质基因表达差异的研究

本实验利用差异显示反转录PCR(DDRT PCR)技术分析单眼视觉剥夺大鼠左、右侧视皮质基因差异表达情况 ,并通过反Northern杂交去除假阳性筛选差异表达基因片段。最终获得 3个差异表达基因片段。通过克隆、测序和同源性比较发现 ,其中一个片段 5’端的 166个碱基与人KIAA0 541蛋白的mRNA编码区的166bp区段有 83%的同源性。

利用mRNA差异显示技术研究香菇发育相关基因

以香菇子实体不分化突变株和对照菌株L98411为材料,利用mRNA差异显示技术研究二者的基因表达差异,共分离到21条差异片段,其中12个分别与泛素、ATP合成酶、锌指蛋白、GTP结合蛋白、延伸因子g1线粒体前体、过氧化物酶、硫酯酶、类TrpB酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、糖苷水解酶、热激蛋白、疏水蛋白等已知基因有较高的同源性,这表明香菇子实体分化发育是一个复杂的过程,涉及到胞内转运、转录调控、细胞分化、蛋白合成、各种代谢途径中的酶、抗逆反应等诸多途径的协同调控。

EGF作用下人脑胶质瘤细胞生长抑制的机理

目的 克隆、测序胶质细胞瘤 BT325细胞在生长抑制量表皮生长因子 (epithelial growth factor EGF)作用下差异表达的基因,了解 BT325细胞生长抑制的分子机制。方法 在生长抑制量 EGF 作用下,用差异显示反转录聚合酶链反应 (differential display reversed transcription polym erase chain reaction DDRT-PCR ) 技 术 分析 人 胶 质 细胞瘤 BT325细胞表达 水 平 明显 差 异 的 cDNA , 对差 异 显 示 基因 进 行 序 列 测定 和 同 源 比较 , 并 用 Dot blot及 Northernblot等方法进行验证。结果 在 EGF 作用下,生长抑制的胶质瘤细胞中出现一些上调和下调表达的 cDNA 片段。克隆、分离了 6个表达明显上调的 ESTs,1个序列为新的基因片段,另 5个与已知基因有不同程度的同源,其中 1个与转醛缩酶基因的编码区同源。新近的研究已发现,转醛缩酶与细胞凋亡有关。结论 高剂量 EGF 可诱导 BT325中许多基因表达水平的改变,EGF 抑制 BT325细胞生长可能与促进转醛缩酶基因的表达而诱导细胞凋亡有关。

肾移植术后外周血淋巴细胞P59^(fyn)和SLAM基因表达的动态观察

目的 :寻找肾移植后初期与免疫排斥相关的差异表达基因 ,探讨肾移植后淋巴细胞活化、信号转导变化的规律与机制。方法 :对 1例心脏瓣膜成形术加肾移植术后患者外周血淋巴细胞的mRNA表达进行基因差异显示分析 ,进而对差异条带进行测序 ,并同时监测肾功能临床生化指标。结果 :差异分析显示 ,在肾移植术中开放动脉后 ,即有酪氨酸蛋白激酶P5 9fyn、signalinglymphocyteactivationmolecule(SLAM)等基因的表达 ,于术后 72h～ 5天降低 ,术后 7天表达出现高峰 ;临床生化检测可见 ,术后患者血中BUN、肌酐和CsA逐渐降低 ,但在第 10天BUN、CsA出现异常升高。结论 :肾移植术后一些与T细胞活化早期信号转导相关基因的表达水平发生改变 ,其中P5 9fyn和SLAM在术后第 7天表达增强 ,较临床生化改变早 3～ 5天 ,提示有可能通过监测这些基因的表达情况 ,来早期、无创地监测肾移植术后器官损伤。

K562细胞向红系分化相关EST的鉴别与分析

目的 鉴别并获取与 K562细胞向红系分化相关的表达序列标签 (expressed sequence tags,EST)。方法利用改进的差异显示反转录聚合酶链反应 (differential display reverse transcription polym erase chain reaction DDRT-PCR )方法,分析诱导前及用氯高铁血红素 (hem in)诱导 36h 后 K 562细胞的差异表达 cDNA 片段,挑选其中差异明显的cDNA 片段,经克隆、测序和基因信息学分析,挑选代表新序列或有一定功能线索的差异表达 EST 进行 Northern 印迹分析。结果 获得诱导前后 K 562细胞的差异表达 cDNA 片段 60条,其中 38条表达上调,22条表达下调。对 40个差异表达明显的 cDNA 片段的生物信息学分析说明,23个 EST 与 GenBank 中已知序列有 95%以上同源性,10个为只与 dbEST 有高度同源的序列,7个未发现同源序列;进行 Northern 印迹分析的 8个差异表达 EST 中,6个 EST 的杂交结果与 DDRT-PCR 显示的差异表达状况一致。结论 改进的 DDRT-PCR 方法能够较好地克服假阳性问题,这些差异表达 EST 的获得为进一步研究红系分化的分子机制和控调网络提供了一定线索。

小鼠衰老相关新基因Arzc的克隆

目的鉴别和克隆与小鼠衰老相关的新基因。方法采用改进的差异显示反转录聚合酶链反应(D DR T-PCR)技术分析正常老化和年轻BA LB/C小鼠大脑皮层m R NA的差异表达,差异显示的新表达序列标签(EST)经N orthern杂交验证后,作为出发序列,利用生物信息学方法设计引物,以小鼠大脑皮层总R NA的反转录产物为模板通过PCR克隆全长cD NA。结果差异显示分析共获得表达差异明显的EST42条,序列同源性分析显示其中29条为已知基因cD NA片段,13条可能为新EST。对新EST进行N orthern杂交验证后,对确证在正常老化鼠皮层表达明显下调的1个EST,通过生物信息学方法克隆全长cDN A,得到1个新的1382bp的cD NA序列,命名为Arzc,获得G enBank注册号A Y344585。该序列含有1个261bp的开放阅读框,推测的编码多肽包含86个氨基酸残基,与噬菌体编码的重组酶/整合酶的一段氨基酸序列有较高同源性。结论鉴别并克隆到一个可能与小鼠衰老相关的新基因A rzc。

大豆与疫霉菌非亲和互作早期差异显示基因的表达分析

大豆疫霉根腐病是大豆的毁灭性病害。为了深入了解大豆对疫霉菌的分子抗病机制,以大豆疫霉菌1号生理小种游动孢子接种抗性品种绥农10的根部及下胚轴,通过反转录差异显示技术分离到疫霉菌侵染0、0.5、1、2和4h后大豆下胚轴和茎部的差异表达基因,其中至少有8个基因与抗病相关。接种后0.5 h开始上调表达的有肉桂酸-4-羟化酶基因、ATP合成酶β亚基基因,以及类花生泛素结合酶基因;接种后1h和2h依次开始上调表达的有尿苷二磷酸-N-乙酰基-α-D-氨基半乳糖基因和豌豆蓝铜蛋白基因;接种后4 h才上调表达的有TGA型碱性亮氨酸拉链基因、大豆环孢素基因和14-3-3蛋白基因。这8个基因中有1个基因与信号传导有关、4个基因与抗病和防御有关、2个基因与转录调控有关、1个基因与能量代谢有关。研究表明,以上8个基因在疫霉菌游动孢子萌发、侵入大豆和在大豆体内扩展过程中起着重要作用。

功能基因组学研究进展

2 1世纪是生物时代和信息时代 ,基因组学的研究已从结构基因组学转向功能基因组学 ,对于基因功能的研究也由单一基因转向大规模、批量分析。文章对功能基因组学及相关学科的概念作了概述 ,介绍了功能基因组学的研究内容与研究方法 ,主要包括应用差异显示反转录 PCR、基因表达序列分析 (SAGE)、微点阵、蛋白质组学和生物信息学等研究基因组表达概况、基因组多样性和模式生物学等。

花生果种皮特异表达基因候选片段的分离

应用改良的琼脂糖凝胶电泳展示DDRT-PCR产物的方法分离花生果种皮特异表达基因,共分离出24条差异表达片段.经测序后排除重复,最终得到8条差异片段.其中1条为花生上已知基因片段,余下7条均为花生上尚未报道过的基因.此7个片段序列已登录Genbank,其登录号分别为DQ450065、DQ450066、DQ450067、DQ450068、DQ450069、DQ450070、DQ450071.同时本研究还对应用琼脂糖电泳分离DD-PCR产物的方法进行了探讨.