萝卜总RNA提取与mRNA差异显示技术

以萝卜幼小花药与叶片为材料,初步建立了mRNA差异显示技术体系.4种提取总RNA方法中,改进的SDS/酸酚法比CTAB/酸酚法和SDS/碱酚法更合适;改进的热硼酸法(HB)提取的RNA质量也较高,但所需时间较长,成本较高.以改进的SDS/酸酚法获得的RNA进行纯化后,其OD260/OD280在2.0～2.2之间,表明RNA样品杂质较少;总RNA进行反转录与差异显示分析表明,高分辨力的cDNA片段在100～380 bp之间.

萝卜mRNA差异显示技术反应体系的优化及应用

以萝卜品种短叶十三为材料，对影响mRNA差异显示（DDRT—PCR）反应体系的主要因子进行优化试验，最终确定了优化体系（15μl）：随机引物0．5μmol／L，锚定引物1．0μmol／L，dNTPs0．1—0．2mmol／L，Mg^2＋1．5mmol／L，模板cDNA 15ng，TaqDNA聚合酶0．9U；并对PCR扩增程序中的复性温度进行梯度筛选，表明40℃较适合于萝卜mRNA差异显示（DDRT-PCR）反应体系。同时应用该优化体系分别对短叶十三花芽分化和扬花萝卜、春萝卜BYC抽薹过程中基因的差异表达进行初步分析。

mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的:建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法:用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果:两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论:应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。

mRNA差异显示技术在分离水稻基因中的应用

mRNA差异显示技术是分子生物学中分离g隆基因的有效技术。笔者叙述了mRNA差异显示技术的基本原理、存在的问题以及技术改进, 并主要阐述了该技术在分离水稻基因中的应用情况。

利用有序差异显示技术克隆受稻瘟病菌诱导表达的水稻cDNA的研究

利用有序差异显示技术 (ODD)分析受稻瘟病菌诱导表达的水稻基因 ,通过反式RNA印迹进行辅助筛选 ,获得了 37个在接种稻瘟病菌后表达量增强的水稻cDNA克隆 .采用RNA印迹对其中 5个克隆在接种稻瘟病菌后的表达分析表明 ,这些克隆在抗病以及感病的水稻株系中都具有诱导表达的特点 .根据序列同源性分析 ,与这些克隆序列相应的同源基因可能涉及抑制病原菌生长、清除真菌毒素、传递抗病信号以及调节宿主生理状态等几方面的功能 .

差异显示技术研究NaHCO_3胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinelliatenuiflora)基因的表达。经ReverseNorth-ern检测,获得了7个差异表达的基因片段。其中,6个为胁迫后诱导表达,1个为胁迫后抑制表达。序列同源性分析表明,胁迫诱导表达的6个基因片段中,1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列,胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高。本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础。

大豆花芽mRNA差异显示技术体系反应条件的优化

为建立适用于大豆花芽的mRNA差异显示体系,以"吉农18"花芽突变体为材料,采用RNAiso Plus试剂盒提取了大豆花芽的总RNA,并对DDRT-PCR体系中的Mg2+、dNTP及Taq酶的用量进行了优化。试验结果表明:适合大豆花芽mRNA差异显示的PCR体系(25μL)为反转录产物用量2.0μL,锚定引物50 pmol/L,随机引物50 pmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.5U。

应用荧光标记信使核糖核酸差异显示技术分离子宫肌瘤相关基因片段

目的:应用荧光标记的信使核糖核酸(messengerribonucleicacid,mRNA)差异显示技术分离子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关的差异基因片段。方法:用4种锚定引物和3种随机引物,共12种组合,结合GenomyxLRTMDNA差异显示系统及GenomyxSCTM荧光图像扫描系统,以及配套的FluoroDDandHI-EROGLYPHmRNAProfile试剂盒,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关差异基因片段的分离。结果:从子宫肌瘤及正常子宫肌组织间分离出相关的差异基因片段27条,差异片段中主要表现为条带密度的强弱差别。结论:子宫肌瘤的产生可能与某些基因表达的差异有关,而差异基因的序列及功能有待进一步研究。

利用差异显示技术克隆小麦抗白粉病相关基因的研究

对小麦—簇毛麦抗病易位系进行差异显示分析,以期获得小麦抗白粉病基因的分子克隆。根据已克隆植物抗病基因的保守域,设计了简并引物,与锚定引物组合,对抗病诱导的小麦抗白粉病易位系进行了差异显示分析,共获得10个差异片段,其中两个片段R3-1和8C1.3-6Northern杂交为阳性。将这两个片段克隆后进行了测序,序列分析结果为两个新序列,GenBank登录号分别为AF498271和AF498272。R3-1没有发现同源性较高的植物基因序列,发现8C1.3-6与Sphenostylisstenocarpa 类几丁质酶基因有同源性。

mRNA差异显示技术评述

真核生物mRNA差异显示技术自1992年建立以来,经过不断的改进与完善已经成为分子生物学领域的重要技术平台之一,为基因的差异表达及表达基因的克隆研究提供了强有力的工具。本文主要对mRNA差异显示技术的原理、优缺点及其近年来的改进与发展进行了介绍和评述。

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究大豆抗疫霉根腐病的分子机制

文章以中国优良大豆品种东农46及大豆疫霉优势生理小种1号菌株为材料,利用mRNA差异显示技术研究东农46与大豆疫霉根腐病菌非亲和互作中前后基因表达的差异,寻找并分离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的9条cDNA片段,通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。

mRNA差异显示技术及其在猪基因组研究中的应用

差异显示是一种快速分离、鉴定不同细胞类型基因表达差异的有效方法。此技术自建立以来便广泛应用于比较研究中 ;

mRNA差异显示技术的研究进展

针对mRNA差异显示技术中的假阳性高和放射性污染等缺陷,文章从改进引物设计、应用非放射性标记、优化PCR参数、假阳性鉴定等方面进行了综述。1采用4种兼并或单碱基引物作锚定引物;用特异和长序列(≥20bp)专一性引物作为随机引物,可增加特异性;在锚定引物之前加上了一段T7启动子序列,在随机引物前加上一段M13重复序列,可使DDRT—PCR的体系的扩增特异性更一致。2针对放射性同位素检测法的缺点,文章提出并比较了几种常用的非放射性同位素标记方法。3保证起始(模板)mRNA质量和浓度,降低dNTP浓度,选择最适的反转录和PCR退火温度,可优化PCR参数。4用两种不同的反转录酶进行反转录平行实验,很容易区分出RNA制备过程中造成的假阳性,目前假阳性鉴定大多还是以Northern印迹为基础,再作些适当的改进。

应用限制性差异显示技术制备实验用DNA标记物

目的 建立实验室用DNA标记物。方法 依据PCR引物设计软件Oligo5设计通用引物 ,对质粒DNA进行PCR。结果 通过PCR反应 ,电泳后可见清晰的DNA条带 ,将已确定长度的DNA片段再进行PCR反应 ,与商用DNA标记物进行比较显示 ,用此法制备的DNA标记物可以作为实验室进行凝胶电泳的DNA标记物。结论 采用限制性差异显示技术制备DNA标记物 ,不仅操作简便、快捷、提高工作效益 ,且大大降低费用 。

用mRNA RT-PCR差异显示技术克隆拟除虫菊酯抗性家蝇细胞色素P450基因片段

细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布在生物有机体中的重要酶系,具有多样的功能。细胞色素P450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的普遍机制。为揭示家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的分子基础,我们利用mRNA差异显示技术(DDRTPCR)从溴氰菊酯抗性品系家蝇Muscadomestica中分离出2个新的基因片段(M1,M2)。序列比对(BlastP)结果表明,M1与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中的Cyp6A9在氨基酸水平上具有54%的相似性,M2分别与果蝇Drosophilasimulans中的Cyp6g1有65%的相似性。M1和M2包含P450的特征序列,并与细胞色素P450具有最高程度的序列相似性,是为细胞色素P450基因片段。

荧光标记mRNA差异显示技术在分离食管癌相关基因片段中的应用

目的 :以荧光标记的mRNA差异显示技术分离食管癌及其正常食管粘膜组织相关的差异基因片段。方法 :结合GenomyxLRTM DNA测序 /差异显示系统及GenomyxSCTM 荧光图象扫描系统 ,以及配套的FluoroDD和HI EROGLYPHmRNAProfileKit,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行检测。结果 :从人食管癌及正常食管粘膜组织间 ,同时直接分离出了相关的癌基因或抑癌基因片段 74条。结论 :该技术方便、快捷 。

信使RNA差异显示技术的最新进展

各种疾病，如肿瘤、遗传性疾病都是一种或多种基因异常表达的结果。寻找、定位疾病相关基因在目前分子生物学研究中占有十分重要的地位，Ｌｉａｎｇ等１９９２年首创了信使ＲＮＡ差异显示技术（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ，ｍＲＮＡ...

用单胚mRNA差异显示技术筛选山羊早期胚胎发育相关基因

用单胚构建的mRNA差异显示技术，对体外培养的山羊早期2、4、8～16细胞期胚胎的基因表达进行研究，并选择1条在2细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明：该片段与人类肽基精氨酸脱亚胺酶基因具有83％的同源性。该基因通过对组蛋白和细胞骨架蛋白翻译后的修饰作用，对早期胚胎发育过程中基因转录和表达的调控起着重要作用，是羊早期胚胎发育过程中的重要影响因子。