用差异显示杂交技术筛选与造血相关的新基因

目的 建立 4月龄人胎肝组织差异表达基因EST库 ,并分离未知功能基因以寻找造血相关的新基因。方法 表达性差异显示技术 (RDA)、核苷酸序列分析、竞争PCR及Northern杂交。结果 建立了 4月龄人胎肝组织差异表达基因EST库。该文库富集了造血及肝生长调控相关基因 ,部分克隆序列测定及分析表明该库含有重要的未知功能新基因 ,具有一株新基因可能与红细胞增殖、分化有关。结论 RDA技术为寻找新的基因提供了有效的手段。

一种新的基因克隆方法——消减杂交差异显示分析方法

消减杂交差异显示分析方法(subtractivehybridizationdifferencedisplay,SHDD)是近年来在cD-NA代表性差异分析方法(cDNARepresentationalDifferenceAnalysis,cDNARDA)和mRNA差异显示分析方法(mRNADifferentialDisplay,mRNADD)的基础上发展而来的一种克隆基因的新方法。SHDD方法结合了cDNARDA的特异性特点与mRNADD在双向筛查差异片段和较高的检测灵敏度方面的优势。在具体技术路线设计上,SHDD最大的特点就是在两样本间双向一轮与二轮均衡、温和消减杂交基础上引入了同位素mRNADD差异显示技术,使得该方法在克隆低丰度信息及较弱差异信息、提高差异分析结果的特异性、减少假阳性、减少重复差异结果,提高差异分析的信息量同时又降低工作量等方面明显优于经典的mRNADD和cDNARDA方法。

长期培养后小鼠造血基质细胞差异表达基因的筛选

为了进一步研究长期培养体系 (long termculture ,LTC)中造血基质细胞调控造血的分子基础及其作用机制 ,并发现新型造血调控因子 ,以LTC体系培养后小鼠骨髓造血基质细胞 (LTC St)为被扣除杂交组 ,以未经培养的小鼠骨髓细胞 (BMC)为扣除杂交组 ,采用抑制性扣除杂交法 (SSH)进行杂交 ,将杂交产物克隆并测序 ,进行生物信息学分析。结果 :获得了 131个差异表达EST克隆 ,这些克隆代表了 2 6种已知或部分已知的不同基因和 7条无任何线索的全新基因 ,5条具有完整开放阅读框架 ,无功能线索的新基因中 3条有信号肽。结论 :通过本实验得到了LTC体系中特异性表达的一个消减文库 ,获得了几条可能与造血调控相关的新型基因或EST 。

SLE及IDDM患者外周血单个核细胞中基因表达差异的研究

目的 :了解系统性红斑狼疮 (Systemiclupuserythematosus,SLE)和胰岛素依赖型糖尿病 (insulindependentdiabetesmellitusdisease,IDDM)外周血单个核细胞 (PBMC)的基因表达概况 ,为探讨这些基因表达的差异与该 2种疾病的关系奠定基础。方法 :以分别来自SLE和IDDM患者的PBMCpolyA+ RNA为模板逆转录合成cDNA表达探针 ,与AtlascDNA表达阵列膜进行差异杂交。结果 :放射自显影结果显示在SLE疾病所分析的 1176种已知基因中 ,有表达差异的 376个 ,其中表达上调差异率大于 3的 8个 ,表达下调差异率大于 6的 6个 ;在IDDM疾病所分析的 1176种已知基因中 ,有表达差异的 5 5 8个 ,其中表达上调差异率大于 6的 13个 ,表达下调差异率大于 6的 3个。与细胞的分化增殖、粘附与信号转导、凋亡、转录与调控及DNA损伤修复等相关的基因表达水平发生了明显的改变。结论 :AtlascDNA表达阵列差异杂交分析为初步了解SLE及IDDN患者PBMC的基因表达概况 ,进而了解基因表达差异在疾病发生发展中的作用提供了一个较好的方法。

几种差异序列分析方法的比较及其研究前景

分离和鉴定不同生物基因的差异序列,有助于功能基因的分离,揭开物种间进化的规律,阐明某些疾病相关基因的作用机理。本文简述了几种近年来常用的筛选差异基因的方法,特别是最新发表的杂交监控差异分析法(HMDA)的原理、适用范围及其特点,重点探讨了HMDA法在真核基因组差异序列筛选中的技术性突破及其研究前景。

功能基因组学及其研究方法

功能基因组学是在结构基因组学丰富信息资源的基础上 ,应用大通量的实验分析方法并结合统计和计算机分析研究基因的表达、调控与功能以及生物的生长、发育规律的新型交叉学科。基因功能研究采用从基因到表型和从表型到基因两种策略 ,使用多种方法创造大量变异及大通量识别并克隆基因和研究基因表达模式的技术。如基因陷阱、基于差异杂交的基因表达差异研究技术、 DNA芯片和蛋白质芯片等。随着研究技术不断改进和创新 ,功能基因组研究将成为生命科学研究的重点和热点。

草菇cDNA削减文库的构建

介绍一种改进的利用差异杂交和定向插入构建全长cDNA削减文库的方法.分别以诱导和非诱导条件培养草菇菌丝,两者都提取总RNA并采用PolyATtract mRNA Isolation System III试剂盒快速提取mRNA,由PowerScriptTM Reverse Transcriptase将诱导菌丝提取的mRNA进一步逆转录成cDNA第一链,用得到的cDNA第一链和非诱导菌丝提取的mRNA进行杂交,将未杂交上的cDNA第一链洗脱浓缩后,用SMARTTM cDNA Library Construction 试剂盒构建成草菇cDNA削减文库.经检测:原始文库滴度为2.5×105 pfu/mL,重组率为93%,插入cDNA大小在0.5～4.0 kb之间,文库扩增后,文库滴度为1.1×109 pfu/mL,并从中克隆到了若干植物纤维降解酶.结果表明其简化了实验步骤,而且更有利于富集所需全长基因,是构建cDNA文库的一种有效改进.

六倍体小麦基因克隆方法研究进展

小麦基因组庞大,重复序列多,重要功能基因的克隆存在很大困难。目前,小麦基因的克隆方法主要有同源克隆、图位克隆、差减杂交、差异显示等。利用各种方法已经克隆出许多小麦基因,并对部分基因进行了功能研究。本文综述了目前常用的小麦基因克隆方法,比较了各种方法的优缺点和应用特点,并举出了利用这些方法得到的重要基因,希望能为从事小麦基因克隆的工作者提供参考信息。

差异甲基化杂交在发现卵巢癌相关基因中的应用

目的:探讨差异甲基化杂交结合生物信息学在发现新的人上皮性卵巢癌相关基因中的应用价值。方法:采用基于芯片技术的差异甲基化杂交(differential methylation hybridization,DMH)的方法检测5例原发性上皮性卵巢癌患者癌组织(以癌旁组织为对照)的DNA异常甲基化位点。利用生物信息学,通过序列比对分析,筛选新的候选的卵巢癌相关基因。结果:上皮性卵巢癌患者癌组织与癌旁组织相比,5张差异甲基化杂交芯片共筛出异常甲基化位点62个;DNA序列比对分析发现,基因EGFLAM启动子区CpG岛(CpG island,CGI)在上皮性卵巢癌中出现低甲基化,提示该基因可能是通过启动子区的异常甲基化参与卵巢癌的发生发展。结论:将基于芯片技术的差异甲基化杂交技术与现代生物信息学相结合,可以有效地发现新的人上皮性卵巢癌相关基因。

代表性差异分析和消减杂交差异显示分析方法在克隆差异基因方面的灵敏度比较

目的建立目的基因差异信息标量化的配对研究体系，比较经典的代表性差异分析（RDA）方法和消减杂交差异显示分析（SHDD）方法在克隆差异基因方面的灵敏度。方法以人类乳头瘤病毒（HPV）DNA为模板行PCR扩增获得376bp和869bp两个片段，作为差异目的基因掺入人血基因组DNA，获得5组目的基因拷贝数呈梯度差异的配对研究体系，比较RDA和SHDD方法的检测灵敏度。结果应用RDA方法可克隆得到上调6倍的376bp片段和上调8倍的869bp的HPV片段，而应用SHDD方法可克隆到上调4倍的两种差异片段。结论SHDD方法由于采用了两样本差异产物问的双向均衡消减杂交，避免了经典RDA方法不均衡消减杂交导致的差异信息的丢失，在克隆较弱的差异信息，尤其是较长差异信息方面，显著优于经典RDA方法。

食管癌及癌旁组织中基因表达的初步研究

目的 了解食管癌的基因表达概况，寻找在食管癌及癌旁组织中差异表达基因。方法 以癌及癌旁组织ｐｏｌｙ Ａ＋ Ｒ Ｎ Ａ 反转录合成的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 为探针，与 Ａｔｌａｓ 微点阵表达分析膜进行差异杂交。结果放射自显影结果显示在所分析的５８８ 种已知基因中，ｃｄｃ２５ Ｂ、 Ｍ Ｍ Ｐ、 Ｍ Ｅ Ｔ 等６１ 个在食管癌组织中表达上调，ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ４ 、 Ｂ Ａ Ｄ、 Ｉ Ｌ１ Ｒ Ｅ Ｃ Ｅ Ｐ Ｔ Ｏ Ｒ Ａ Ｎ Ｔ Ａ Ｇ Ｏ Ｎ Ｉ Ｓ Ｔ、 Ｉ Ｌ６ 等２２ 个表达下调，参与细胞增殖、凋亡、分化和转移调控的多种基因的表达水平发生了明显改变。结论 这些基因的表达改变组成了一个食管癌特异的基因表达谱，首次为食管癌细胞的恶性表型提供了分子遗传学参考数据，一些与肿瘤发生相关的差异表达基因为发展生物标记物或肿瘤早期诊断和治疗提供了线索。 Ａｔｌａｓ 微点阵表达分析滤膜的差异杂交为初步了解某一组织或细胞的表达状况提供了一个较好的方法。

正常脾脏与肝硬化脾脏组织基因表达概况分析

目的 了解正常脾脏与肝硬化脾脏的基因表达概况 ,寻找在两者之间的差异表达基因。方法 以正常脾脏及肝硬化脾脏组织的总RNA反转录合成含有α 3 2 PdATP的cDNA为探针 ,与Atlas微阵列表达分析膜进行差异杂交。结果 放射自显影结果经AtlasImageTM 软件分析显示 :在所分析的 5 88种已知基因中 ,CK8、ICE LAP6、PISSLARE等 32个在肝硬化脾脏组织中表达上调 ,byglycan、Caspase 10、CRAF 1等 45个表达下调 ,参与细胞增殖、凋亡、分化、细胞间相互作用 ,与细胞侵袭相关的基因表达水平发生了明显改变。结论 通过Atlas微阵列系统分析发现的这些基因的表达改变组成了一个不同情况下脾脏特异的基因表达谱 ,是人类首次全面系统地研究脾脏的基因表达改变 ,一些与脾脏变化有关的差异表达基因 ,对彻底了解脾脏在肝硬化过程中的变化及其所发挥的作用有重要的意义。Atlas微阵列技术的应用将为人类了解疾病的发生、发展过程提供一个较好的方法。

微阵列分析肝癌组织中的整合素

目的了解肝癌中整合素的表达概况,探寻在肝癌及正常肝组织中的表达差异。方法以肝癌及癌旁正常肝组织的总 RNA 反转录合成含有α^(32)P dATP 的 cDNA 为探针,与 Atlas 微阵列表达分析膜进行差异杂交,并应用半定量 RT-PCR 验证。结果放射自显影结果经 AtlasImage^(TM)软件分析显示:在所分析的588种已知基因中,整合素相关的基因共有17个,其中 integrin alpha8、betal、beta7、beta8等4个在肝癌组织中表达上调。结论通过 Atlas 微阵列系统分析发现的这些基因的表达改变组成了一个肝癌特异的基因表达谱,是人类首次全面系统地研究肝癌的基因表达改变,整合素基因的差异表达为研究肝癌的侵袭、粘连和转移机制提供了有益的线索。