小麦矮腥黑穗菌差异片段筛选与分子检测体系的建立

采取随机扩增DNA多态性(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)引物介导的半特异PCR技术(RAPD primer mediated hemi-specific PCR,RM-PCR),在从不同地域征集的18个小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)菌株和29个小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries(DC)Tul,TCT)菌株的总基因组DNA中筛选鉴定出TCK独有的大小为1322bp差异基因组片段。根据该片段序列设计筛选出2对特异性引物CQUTCK2/CQUTCK3和CQUTCK4/CQUTCK5,均可以从18个TCK菌株的菌丝体和冬孢子DNA中稳定地扩增出747bp和200bp的单一靶带DNA,而在29个TCT菌株的菌丝体或冬孢子DNA均无任何扩增产物。以腥黑穗菌属通用引物对CQUK6/CQUK7为内置对照,可以确定被检样品是否含PCR抑制物质进而判断检测体系是否正确,同时有效地排除样品检测结果的假阳性和假阴性。采用建立的TCK特异PCR检测技术体系,实现简单而快速地鉴定小麦矮腥黑穗菌冬孢子或罹病小麦组织中侵染菌丝体的目的。

双孢蘑菇丛生变异的RAPD分析及差异片段的克隆

通过双孢蘑菇正常菌株及其丛生变异菌株基因组DNA的RAPD研究,找到一个与双孢蘑菇丛生变异可能相关的DNA片段,将其克隆并测序.GenBank查询结果表明该片段可能的部分开放读框(ORF)与多种生物的二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)的部分氨基酸序列有较高的同源性,由此提出了一个双孢蘑菇丛生变异的分子机理假设.

反向Northern筛查冠心病血瘀证差异片段

目的 :降低mRNA差异显示假阳性。方法 :采用反向Northern杂交方法进行筛查差异片段的真实性。结果 :差异片段再扩增后经检测符合杂交条件的有 96条 ,反向杂交后 ,有 10条DNA片段属于真实的差异片段。结论

生物信息学在克隆去势SD大鼠cDNA消减差异片段SCn4的全长cDNA及其序列分析中的应用

从去势SD大鼠cDNA消减文库中抽取消减差异未知基因的cDNA部分序列,利用生物信息学的方法延伸表达序列标签(Expression Sequence Tag,EST)序列,以获得基因的部分乃至全长cDNA序列,避免或部分避免构建与筛选cDNA文库等烦琐的实验室工作。该策略体现了后基因组生物信息学的重要性,它在克隆确定致病新基因方面提供了新思路、新方法。本研究利用生物信息学“电子”克隆了去势SD大鼠cDNA消减文库中的差异片段SCn4的全长cDNA并对其可能的全基因序列作了预测。

应用MS-RDA筛选胃癌甲基化差异片段

目的:应用甲基化敏感性代表性差异分析法(methylation-sensitive representational difference analysis,MS-RDA)筛选胃癌和正常胃组织间甲基化差异DNA片段．方法:通过MS-RDA筛选胃癌和正常胃组织间DNA甲基化差异片段,经克隆、测序后进行生物信息学分析．结果:获得3个甲基化差异片段,分别为 CRS1308,CRS1309,CRS1310k列,其中 CRS1309和CRS1310已被GenBank收录,登陆亏分别为AY887106和AY887107,CRS1309 序列与LOC440683基因第11外显子、 LOC440887基因的3’端,DRD5基因启动子和外显子区域均有很高的相似性(分别为98％,99％, 94％),CRS1310序列与1999年Minoru Toyota在人类结肠癌中分离出的核糖体RNA上的甲基化差异性CpG岛有很高的相似性(98％)．结论:胃癌和正常胃组织间DNA甲基化存在差异,MS-RDA可有效分析这两种不同组织间甲基化的差异,筛选出有意义的甲基化差异片段.

抑制差减杂交克隆E1 Tor霍乱弧菌流行株与非流行株基因组差异片段及其分析

为了克隆与分析霍乱弧菌O1E1Tor流行株与非流行株两类菌株基因组差异片段 ,采用抑制差减杂交技术 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)分别以国内保留的流行株Wujiang 2及非流行株Js 32一株作为被检菌 ,另一株作为参考菌进行基因组差异研究 .在进行的差减杂交实验中 ,流行株Wujiang 2共检出 34个特异差异片段 ,经同源检索共代表 35个基因片段 ,其中包括许多重要的霍乱弧菌毒力相关基因如CTX遗传单元、TLC因子及可移动外来成分如霍乱弧菌整合子RVC序列及Tn10转位酶 .非流行株Js 32共检出 14个特异差异片段 ,经同源检索未能检出同源片段 ,可能代表新基因序列 .研究表明 ,霍乱弧菌流行株与非流行株基因组存在较多差异基因 ,表现在毒力、毒力相关基因。

胃癌DNA甲基化差异片段的筛选与分析

目的筛选和分析胃癌和正常胃组织间DNA甲基化差异片段。方法通过甲基化敏感性代表性差异分析法(methylation-sensitive-representationaldifferenceanalysis,MS-RDA),筛选胃癌和正常胃组织间DNA甲基化差异片段,经克隆、测序后进行生物信息学分析。结果获得3个甲基化差异片段CRS1308、CRS1309、CRS1310序列。其中CRS1309和CRS1310已被GenBank收录,登陆号分别为AY887106和AY887107。CRS1309序列与LOC440683基因、LOC440887基因的3'端、DRD5基因均有很高的相似性;CRS1310序列与1999年MinoruToyota在人类结肠癌中分离出的核糖体RNA上的甲基化差异性CpG岛有很高的相似性。结论胃癌和正常胃组织间DNA甲基化存在差异,LOC440683、LOC440887、DRD5基因的异常甲基化可能与胃癌的发生相关,胃癌中CRS1310序列所在核糖体RNA上的CpG岛易发生甲基化。

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的探测人直肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段,了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法应用抑制性消减杂交技术,获得人直肠腺癌差异表达的基因,用生物信息学cDNA文库筛选的方法,对人直肠腺癌cDNA消减文库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆,提取质粒,双酶切分析,进行序列测定,得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA(Genbank登录号为BM360862),用cDNA文库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析(SAGE)显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论直肠腺癌的发病是多环节和多步骤的过程,9cDNA与直肠腺癌发病相关,对9cDNA基因差异片段进一步研究,将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。

肝癌细胞表达差异片段MRG 98.2的临床意义

目的筛选肝细胞癌（ＨＣＣ）相关基因，探讨其在ＨＣＣ发病中的临床意义。方法用差异显示技术对比研究正常肝组织、ＨＣＣ组织及癌旁肝组织之间ｍＲＮＡ的表达差异，以肝癌ｃＤＮＡ片段ＭＲＧ９８．２为探针，对１０例ＨＣＣ及癌旁肝组织进行斑点印渍分析，并通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测这些标本血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ的表达水平。结果从ＨＣＣ组织中获得的差示片段ＭＲＧ９８．２在７例ＨＣＣ标本中表达阳性（７０％），癌旁肝组织弱表达（２／１０）或无表达。 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ在７例ＭＲＧ９８．２阳性表达的ＨＣＣ组织中６例表达上调。结论 ＭＲＧ９８．２是ＨＣＣ相关的基因片段，其表达与ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ相关，并可能与肿瘤浸润转移、患者的预后不良有关。

云南省鼠疫菌株差异片段基因分型及其流行病学特征

目的对云南省鼠疫菌株进行基因分型，探究云南各型菌株之间的内在联系。方法选取云南家鼠、野鼠及玉龙鼠疫菌共171株进行试验，采用鼠疫菌基因组23个差异片段（DFR）进行分型，并运用BioNumerics5．0进行聚类分析。结果23个差异片段将171株鼠疫菌分为7个基因组型：Genomovar5、Genomovar7、Genomovar9型及4个新发现的基因型。7株玉龙型菌株都为Genomovar5基因型；16株野鼠型（滇西纵谷型）鼠疫菌株被分为3个基因型，其中13株为Genomovar7基因型，2株为Genomovar9基因型，1株为新发现的Genomovar—ynl基因型；148株云南家鼠型（滇闽居民型）鼠疫菌株被分为4个基因型，其中145株为Genomovar9基因型．3株为3个新发现的基因型，分别为Genomovar-yn2、一yn3、一yn4基因型。生态型聚类分析显示，玉龙型鼠疫菌株与滇西纵古型（野鼠型）菌株的基因型较为相似（87．20％），与滇闽居民型（家鼠型）相似度较小（73．75％）。2株滇西纵谷型菌株与滇闽居民型的主基因型同为Genomovar9基因型。滇西纵谷型Genomovar-ynl基因型与Genomovar7基因型相似，但缺失DFR11。滇闽居民型Genomovar-yn2、-yn3、-yn4基因型与Genomovar9基因型相似，但分别缺失了DFRIO、DFR9、DFR11。结论在野鼠型鼠疫菌株中新发现了1种基因型，在家鼠型鼠疫菌株中新发现了3种基因型，在野鼠型鼠疫菌株中发现了家鼠型鼠疫菌株。玉龙鼠疫菌株的基因型与滇西纵谷型（野鼠型）菌株的基因型相似较高，与滇闽居民型（家鼠型）菌株的基因型相似度较小。

小麦抗黄矮病相关基因cDNA-AFLP差异表达片段的验证

cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达的有利工具,广泛用于植物抗病、抗逆和生长发育等研究领域。本研究以cD-NA-AFLP技术分离的抗黄矮病小麦与感黄矮病小麦间差异表达片段为对象,利用反向Northern方法,从cDNA-AFLP技术筛选的46个候选抗黄矮病防御基因差异表达片段中,筛选出抗黄矮病相关防御基因片段6个;采用对回收的差异片段进行再扩增(延伸引物再扩增),再与原选扩产物一起进行PAGE电泳分析法,并结合半定量RT-PCR分析法,又验证了候选抗黄矮病相关基因表达片段3个。反向Northern方法以及对回收的差异片段进行再扩增(PAGE再分析法),结合(半)定量RT-PCR分析方法,可以比较准确地验证cDNA-AFLP所筛选出的基因差异表达片段。

年轻与衰老2BS细胞中差异表达基因片段的筛选及特征分析

为探索人衰老机制 ,采用差异显示法分别从年轻和衰老 2BS细胞中筛选出特异的cDNA片段 .衰老相关细胞cDNA片段长 2 86bp ,命名为orc ,GenBank登录号为AI35 30 6 5 ;年轻相关的cDNA片段长 2 35bp ,命名为yrc ,GenBank登录号为AI35 30 6 4.Southernblot分析表明 ,yrc在衰老和年轻2BS细胞、BGC 82 3细胞中的BamHⅠ酶切图谱均出现约 3 0kb杂交带 .Northern印迹分析显示 ,yrc在年轻和衰老 2BS细胞中均有 1 0kb和 0 5kb杂交带 ,其中 1 0kb带在两种细胞间差异不大 ,而0 5kb带则在年轻细胞中明显高于衰老细胞 .在胎儿心、肺、肝中也可见 0 5kb和 1 0kb两条杂交带 ;而在胎盘及胎儿肌肉、肾、脑、皮肤中 ,则只可见 0 5kb杂交带 ,无 1 0kb带 .orc基因转录本长约 2 0kb ,在衰老 2BS细胞中的表达高于年轻细胞 .结果表明 ,orc和yrc分别与细胞衰老和年轻相关 ,yrc 0

一个在肺腺癌细胞系中差异表达cDNA片段的定位及表达分析

为了研究和克隆肺癌转移相关候选基因 ,探讨肺癌发生及转移的分子基础 ,应用细胞培养、cDNA克隆、North ern印记杂交和生物信息学技术分析了在细胞来源相同 ,但转移能力不同的肺腺癌细胞系AGZY83 a和Anip973中差异表达片段OPB7 1在人不同组织中和不同人肺癌细胞系中的表达情况 ,并应用RH定位技术对该片段进行了基因定位。表明OPB7 1与已知基因同源性差 ,该基因在正常人多种组织中有表达 ,心肌和骨骼肌中高表达 ,转录本均为 3 0kb左右。在不同人肺癌细胞系中存在该基因的表达差异 ,高转移潜能、低分化及高浸润的细胞系中呈高表达趋势 ,且表达的片段大小略有差别。提示OPB7 1是一个具有广泛表达谱的基因 。

片段长度差异等位基因特异性PCR—一种改良的SNP分型新方法

目的建立一种基于等位基因特异性PCR原理的改良SNP分型新方法:片段长度差异等位基因特异性PCR,并考察特异性引物的3'端第3位、第4位碱基错配对特异性延伸的影响。方法以SNP位点rs759117和rs760887为例,设计两条长度不同、3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时在两个等位基因特异性引物3'端第3或第4位碱基引入错配以增加特异性,下游为公用引物。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP纯合子为长度不同的单一谱带,杂合子则为两条带,其结果与直接测序完全一致。两条特异性上游引物3'端第3或第4位碱基引入错配后非特异性延伸显著减少,且对PCR反应条件的严格性要求明显降低。结论片段长度差异等位基因特异性PCR是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;两条特异性引物3'端第3。

布鲁氏菌强毒株与弱毒株基因组DNA差异基因筛选与鉴定

本研究应用代表性差异分析技术(RDA)对流产布鲁氏菌强毒株544A和弱毒株104M进行基因组差减分析。经过3轮差减杂交,获得强毒株特有的9条差异片段和弱毒株特异的17条差异片段。经BLAST分析和PCR鉴定,最终证实3条差异片段,与流产布鲁氏菌经典弱毒株S19同源性在98%～99%之间,只在弱毒株104M基因组中检测出,而在强毒株544A中不存在。该实验为建立布鲁氏菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础。

白花泡桐茎和叶差异表达的cDNA-SRAP分析

以白花泡桐茎和叶为材料,利用cDNA-SRAP分子标记技术,对其进行基因表达的差异分析。从64对引物中筛选出25对扩增效果较好的引物对进行扩增,检测得到36个差异片段,2次PCR扩增重复率为66.8%。经挑选回收、克隆和测序,最终测得23条差异片段序列,长度主要在400~1 700bp之间。经BLASTX进行比对和功能分析,16条与已知功能基因有较高同源性,包含能量与代谢(34.78%)、蛋白质合成(8.70%)、细胞壁相关(4.35%)、信号传导与胁迫响应(8.70%)及复合影响(13.04%)等多个方面;7条与未知功能基因序列有较高同源性。

不同方法鉴定差异显示技术RAP-PCR得到差异基因的比较

目的:评价用RAP-PCR法从测序胶上得到深海细菌(Shewanella piezotolerance WP3)差异片段验证的最佳方法。方法:用RT-PCR,RNA点杂交,荧光实时定量PCR对不同盐浓度的差异片段进行对比实验。结果:3种方法均能检测到片段的差异表达:RT-PCR灵敏性最强,RNA点杂交需要的RNA量最大,荧光实时定量PCR精确性最高。结论:在实验条件允许下,用荧光实时定量PCR对较少片段的验证较好。

运用mRNA差异显示技术研究黄伞发育相关基因

采用mRNA差异显示技术对黄伞菌丝体、原基、菇蕾、子实体菌柄和子实体菌盖进行研究,获得了在生殖生长阶段差异表达的4条cDNA片段T_(11)G B0304、T_(11)G B0304-2、T_(11)G B0322与T_(11)C B0310,经过回收、重扩增、克隆与鉴定后进行测序分析,结果发现T_(11)G B0322的序列在GenBank中与氧类固醇结合蛋白(oxysterol-binding protein)基因序列的同源性达到41％。再经过半定量PCR方法验证,表明T_(11)G B0322基因片段是在生殖生长阶段差异表达的基因片段。

银染mRNA差异显示法的建立及其应用

以银染 m RNA差异显示方法对原发及转移灶胃癌标本总 RNA为研究对象进行银染差示分析和回收差异条带 ,从中获得系列差异表达片段 .随机选取 5个从原发性胃癌样品回收的表达条带 ,以取自体外培养胃癌细胞株的 RNA进行点杂交验证 ,均被证实为真实带 .对 2个差异表达片段进行分析、测序和 Gen Bank同源比较结果表明 :MGD1片段与肿瘤转移相关基因 MTA1完全同源 ,属胃癌转移相关基因 ;PGD2与胃癌转移抑制相关 ,并与细胞周期抑制蛋白 p2 7/ Kip1具 99%的同源性 .结果表明 ,银染差异显示法具有快速、直观、假阳性率低等优点 。