差异表达基因分离技术的研究进展

分离并克隆差异表达基因是生命科学的研究热点。近年来,以差示筛选、扣除杂交等基本方法为基础,先后出现了抑制差减杂交,微阵列技术等多种分析差异表达基因的技术,使差异表达基因分离方法不断完善。对这些方法的优缺点、发展趋势及应用前景进行了简要综述。

差异表达基因分离技术研究进展

研究不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下(正常状态、发育、衰老、损伤及疾病)差异基因的表达状况,将有助于了解调控细胞分化的机制,为分析生命活动过程提供重要信息。而分离与克隆差异表达的基因是了解这些生命过程的基础。1990年以来,出现了mRNA差异显示技术、代表性差异分析、抑制性削减杂交、cDNA微阵列技术等多种分离差异表达基因的手段,本文对以上方法的优缺点、发展趋势及其应用前景作了简要综述。

用表达性差异显示分析技术分离人胎肝组织选择性表达基因

目的 :建立 4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库 ,为研究胚胎肝组织特异表达基因提供有力的工具。方法 :采用表达性差异显示分析 (representationaldifferenceanalysis,RDA)技术建立 4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库 ,并测定部分克隆核苷酸序列 ,以竞争PCR检测代表性基因的差异表达。结果与结论 :以珠蛋白家族基因为标志 ,所建差减cDNA文库中α 珠蛋白家族基因的表达频率较未差减cDNA文库增高 7倍 ,同时该文库也含有多种与肝生长密切相关的基因 ,表明RDA技术确是研究差异表达基因的有效手段 ,所建EST库富集胎肝特异表达基因 .部分克隆序列分析获得 2种未报道序列 ,其中一株含有丝 /苏氨酸激酶结构域 。

辣椒应答疫霉差异表达基因cDNA分离技术平台建立与应用

植物在逆境胁迫下大量基因的表达往往会发生改变,最终导致对逆境的诱导抗性。剖析逆境作用下差异表达基因的功能是阐明植物抗逆分子机制的重要途径,而获得逆境作用下差异表达基因的全长cDNA是上述研究的基础。建立获得辣椒应答疫霉侵染差异表达基因全长cDNA的技术平台:利用抑制性差减杂交技术构建辣椒叶片在疫霉侵染下的SSH文库,随机挑取150个克隆测序,获得24个功能已知的序列,BLASTN分析发现这些差异表达基因从功能上可分为能量代谢过程、信号传递、光合作用、抗逆反应等几种类型;利用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术与SMARTTM(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)建库技术相结合的方法,构建了辣椒全长均一化cDNA文库,该文库含有1.8×106个独立克隆,插入片段平均长度为1.75kb,重组率为97%;基于SSH获得的差异表达基因序列设计特异性引物,从均一化文库中分离获得其相应的cDNA,结果表明:所获得的差异表达基因cDNA片段相对应的cDNA阳性克隆均为全长cDNA,所构建的SSH和均一化cDNA文库可较好地应用于辣椒应答疫霉等逆境差异表达基因全长cDNA的分离,为进一步开展差异表达基因的功能鉴定奠定基础。

荧光差异显示技术在分离细菌体内诱导表达基因中的应用

面对复杂的宿主环境,细菌是通过调节表达不同的毒力基因实施其感染过程。目前已建立起多种分析鉴定体内特异表达的细菌毒力基因的方法,其中荧光差异显示技术的应用为鉴定细菌的毒力基因以及揭示细菌致病机理开辟了新途径。本文对此作一扼要综述。

分离差异表达基因的方法

了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况 ,可以为研究生命活动过程提供重要信息。以差别筛选 ,扣除杂交等基本方法为出发点 ,研究基因表达差异的方法不断完善 ,先后出现了DDRT PCR ,RDA ,SSH ,cDNA微阵列 (基因芯片 )等技术。这里着重对这些方法的优缺点及改进进行了论述和评介 ,并对技术的发展趋势进行了分析。

用DDRT—PCR技术分析快速老化模型鼠衰老相关基因的差异表达及针刺的作用

目的:研究衰老相关基因的表达差异及针刺的作用,试图从分子水平说明针刺抗衰老的机理。方法:采用DDRT-PCR技术,以快速老化模型鼠(SAM—P/10)为材料,针刺“人中”、“内关”和“太冲”3穴,分析了SAM鼠伴加龄脑细胞基因表达的差异及针刺的作用。结果:针刺前某些基因的表达随增龄发生一定的变化,显示与衰老相关;而针刺后,其表达均受到影响,其变化均趋同于年轻组。结论:针刺不仅具有调节作用及腧穴特异性,而且可能通过这种调节作用影响衰老相关基因的表达而干扰衰老进程。

利用cDNA—AFLP技术研究玉米基因的差异表达

利用 c DNA- AFL P技术 ,对玉米强优势组合和弱优势组合及其双亲自交系在苗期和雄穗生长锥伸长期的基因表达进行了分析。结果表明 ,玉米强优势组合和弱优势组合的基因表达有明显差异 ,基因表达有多种类型 ,表现出质和量的差异 ,不仅有增强 ,也有双亲沉默 ,弱优势组合双亲沉默的数量在苗期和雄穗生长锥伸长期均高于强优势组合 。

引物退火控制技术在差异表达基因克隆中的应用

许多年以来，分离差异表达基因的方法仅限于差异筛选cDNA文库，直到1992年Liang等发明了一种检测基因转录模式的方法，即mRNA差异显示技术（mRNA Differential Display Reverse Transcription PCR，DDRT-PCR），第一次实现了同时陕速灵敏地检测到真核细胞中大部分的差异表达转录体的目的。

差异显示技术研究NaHCO_3胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinelliatenuiflora)基因的表达。经ReverseNorth-ern检测,获得了7个差异表达的基因片段。其中,6个为胁迫后诱导表达,1个为胁迫后抑制表达。序列同源性分析表明,胁迫诱导表达的6个基因片段中,1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列,胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高。本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础。

用高密度cDNA微阵列技术检测鼻咽癌差异表达基因

背景与目的:鼻咽癌的发生与发展涉及多个步骤、多个因素的参与,对此目前尚缺乏了解。本研究试图通过大规模检测鼻咽癌的基因差异表达来揭示鼻咽癌的差异表达基因谱,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因。方法:用由18000个基因构建的高密度cDNA微阵列对21例鼻咽癌分3个样本池分别检测并与鼻咽非癌组织作对比分析,随机选2个基因用半定量RT-PCR验证检测结果。结果:3个样本池鼻咽癌差异表达基因分别为186个、95个和36个,总数达317个,表达上调的277个,表达下调的40个;差异表达基因中2个样本池以上有共同差异表达的基因有23个,表达上调的16个,表达下调的7个;其中3个样本池表达均有差异者6个,5个上调、1个下调,5个上调的基因中2个是已知基因,3个是未知基因,1个下调的是未知基因。结论:本研究揭示了鼻咽癌的基因表达谱,为了解鼻咽癌发生、发展的分子机理提供了大量信息,为寻找鼻咽癌相关基因提供了重要线索。

基因芯片技术筛选孕期缺锌仔鼠脑中差异表达基因

目的: 探讨母鼠在孕期和哺乳期缺锌对仔鼠成年后脑功能特别是学习记忆能力的影响,考察孕期缺锌母鼠所产仔鼠脑内基因的差异表达状况并筛选相关差异表达基因。方法: 怀孕ICR雌鼠24只随机分为(A)对照组,(B)孕期及哺乳期轻度缺锌组,(C)孕期严重缺锌组。对照饲料、轻度缺锌饲料及缺锌饲料的锌含量分别为100 mg/kg、5 mg/kg和1 mg/kg。仔鼠断乳后饲喂普通市售饲料。A、B组仔鼠70日龄(P70)后以穿梭箱法测试仔鼠的学习记忆能力,并制备海马脑片检测仔鼠长时程增强(LTP)变化情况;以A组仔鼠作对照,基因芯片技术检测C组仔鼠(P1)脑中差异表达基因。结果: C组仔鼠出生后即死亡。行为测试中,B组仔鼠达到学习标准所需次数多于A组仔鼠,二者有显著性差异;B组仔鼠海马脑片诱导的LTP低于A组仔鼠;基因芯片检测初步确认C组仔鼠脑中有8条差异表达基因(A组仔鼠作对照,表达差异2倍以上),其中5条锌上调序列,3条锌下调序列。结论: 孕期及哺乳期轻度缺锌即可造成仔鼠成年后学习记忆能力下降,同时也影响海马的突触可塑性,故孕期是锌缺乏造成脑功能损伤的关键时期;孕期缺锌引发的仔鼠成年后脑功能损伤可能与神经细胞Ras-MAPK信息传递途径中MAPKK2表达紊乱有关。

mRNA差异显示技术在分离水稻基因中的应用

mRNA差异显示技术是分子生物学中分离g隆基因的有效技术。笔者叙述了mRNA差异显示技术的基本原理、存在的问题以及技术改进, 并主要阐述了该技术在分离水稻基因中的应用情况。

应用基因表达谱芯片技术克隆甘草甜素诱导Jurkat细胞后的差异表达基因

目的:应用基因芯片技术,阐明甘草甜素作用于T淋巴细胞之后,甘草甜素对于T淋巴细胞基因表达谱的影响. 方法:应用基因表达谱芯片技术,对甘草甜素诱导的Jurkat 细胞和以生理盐水处理的相同细胞的mRNA进行差异显示分析,研究甘草甜素诱导人T淋巴细胞系Jurkat细胞后的差异表达基因. 结果:Jurkat细胞经甘草甜素诱导后,所检测的1152条目的基因中有30条产生差异表达,其中12条基因表达增强, 18条基因表达降低.表达增强的基因主要有:胸腺素及促胸腺生成素蛋白编码基因;白介素-18(IL-18);细胞代谢相关酶类.表达降低的基因主要有细胞信号转导相关基因(如血清/糖皮质激素调节激酶、丝裂素活化的蛋白激酶激酶激酶2、磷脂酶2调节亚基β、鸟嘌呤核苷结合蛋白、神经营养的酪氨酸激酶3型受体等);La自身抗原. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了甘草甜素诱导T淋巴细胞后差异表达基因,为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供依据.

应用基因表达系列分析(SAGE)技术研究高温处理前后家蚕的基因表达差异

高温对家蚕的生理和免疫能力有明显影响。为从分子水平上探究家蚕抗高温机制,应用基因表达系列分析(SAGE)技术获得家蚕5龄雌蚕高温处理前后中肠、丝腺和脂肪体组织的基因表达谱,构建高温组(34℃)和常温组(26℃)2个家蚕SAGE文库。2个家蚕SAGE文库分别包含3555107和3580976个原始标签,其中的标签种类分别为113684和131 296个,清洁标签的种类分别为45972和49467。比较2个文库清洁标签获得65 535种差异标签,共注释4249个基因,其中有1 062个差异表达的基因(P<0.05,错误检测率FDR≤0.001并且拷贝数的差异在2倍以上)。经GO分析发现2个文库中基因的分布极其相似,表明这些基因在不同的环境温度下有类似的生物学功能并参与类似的生理代谢过程。KEGG pathway分析显示有732个基因涉及176个KEGG路径,其中有40个为差异表达基因显著富集的路径(P<0.05),超过一半的路径与代谢、生物合成和信号传导有关。上述结果有助于对家蚕抗高温基因的鉴定以及探究基因调控的网络关系。

开放的差异基因表达技术研究进展

自 90年代早期发展以来 ,差异基因表达 (DGE)技术在许多领域得到了应用 .“开放”结构系统的DGE技术不需原始的生物学或序列信息 ,而且可应用于任何种群 .主要介绍 6项开放的DGE技术 :cDNA代表性差示分析 (cDNA RDA)、基因表达系统分析 (SAGE)、表达序列标签串联排列连接(TALEST) ,和早期的DGE技术差异显示 (DD)、随机引物聚合酶链反应 (AP PCR) ,以及一项受专利保护的技术———GeneCalling .通过几项重要的参数对这些技术进行了比较 ,认为DD虽然有其致命的弱点 ,但在目前仍然应用得非常广泛 .cDNA RDA能有效富增特异片段 ,扣除共有序列 ,如能和SAGE结合 ,将能进一步促进其发展 .TALEST和GeneCalling操作较简便 ,一次试验能获得大量的数据 ,但是分析这些数据比较麻烦 ,须借助另外的分析软件 .最后介绍了应用DGE技术取得的最新成果 .

RNA测序技术在筛选食管鳞癌差异表达基因中的应用

目的构建食管鳞癌组织与配对远癌旁正常食管组织的差异表达基因库。方法应用RNA测序技术及差异分析软件筛选并分析食管鳞癌与癌旁正常食管黏膜的差异表达基因库,通过Real-time PCR验证部分差异表达基因。结果应用RNA测序技术检测发现,食管鳞癌与配对癌旁正常食管组织间共142个(93个表达上调,49个表达下调)差异表达基因。其中,与增殖相关的基因16个(11个表达上调,5个表达下调);与细胞迁移功能相关基因9个(7个表达上调,2个表达下调);与细胞黏附相关基因12个(均表达上调);与血管生成功能相关基因2个(均表达上调);与凋亡相关基因6个(4个表达上调,2个表达下调)。通过Real-time PCR方法检测其中5个差异表达基因,证实癌及癌旁正常组织mRNA表达水平间差异有统计学意义,且上调或下调趋势与RNA测序结果一致。结论应用RNA测序技术成功构建食管鳞癌差异表达基因库,差异表达基因与肿瘤的增殖、迁移、黏附、血管生成及凋亡等生物学行为密切相关。

运用差异展示分离特异性表达的基因

在高等生物中含有约１０００００个不同的基因，其中仅有１５％的基因在任何个体细胞中均表达．因此分离特异的目的基因便显得十分重要差异展示是通过部分扩增ｍＲＮＡ的逆转录产物、经测序胶电泳，分离到差异性表达的基因它与消减杂交相比是分离特异表达基因的更有效的手段．虽然这种方法在实际运用中存在着这样或那样的困难，但随着对这种技术的不断改进，它将会有越来越广泛的用途．

利用引物退火控制技术克隆日本囊对虾性腺差异表达基因

为了解日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)性腺发育及分化的分子机制,本研究采用改良的引物退火控制技术克隆到了共8个精巢、卵巢的差异表达基因.其中4个为已知基因,分别为凝血酶敏感蛋白基因、皮质棒蛋白基因、增殖细胞核抗原基因和泛素缀合酶基因;4个为未知基因,分别命名为MjACP3-T、MjACP4-T、MjACP15-T和MjACP4-O基因.采用实时定量PCR方法分析了4个未知基因在性腺发育过程的表达谱,结果表明:MjACP3-T、MjACP4-T和MjACP15-T基因在日本囊对虾精巢和卵巢中的表达量有显著差异,且在各个时期精巢的表达量均高于卵巢,说明这3个基因可能在精巢的发育中起到某些重要作用.卵巢MjACP4-O基因的表达量变化较大,第5期卵巢的相对表达量达到最高(为1.38),而其他各个阶段的变化较大,在第4期卵巢的相对表达量最低(为0.03).在精巢中,MjACP4-O基因的表达量随着精巢逐渐发育成熟呈下降趋势.定量PCR结果与引物退火控制技术的结果有着很好的一致性.研究结果表明,引物退火控制技术是一种简单高效的克隆差异表达基因的技术.采用该技术所克隆到的8个精巢、卵巢的差异表达基因,为进一步了解日本囊对虾性腺发育分化的分子机制提供了基础材料.