意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的差异表达microRNA及其调控网络

【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答,并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK和AmT)进行高通量测序,首先对原始数据进行质控和评估,随后将过滤后的数据与西方蜜蜂(Apis mellifera)参考基因组进行比对;将比对上的序列标签(tags)注释到miRBase数据库,得出已知miRNA的表达量;通过TPM(tags per million)算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理,以|log_2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA;利用TargetFinder软件预测显著DEmiRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG代谢通路(pathway)富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后,利用茎环反转录PCR(Stem-loop RT-PCR)和荧光定量PCR(qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段(raw reads),经严格过滤后得到的有效读段(clean reads)数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA,包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因,其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目,主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等;下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目,主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示,上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路,富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA,分别有31和52个靶基因注释到内吞作用,15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解,11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路,1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络,7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA,8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析,并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络,研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控,可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。

POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA的筛选、靶基因预测和生物信息学分析及其调控机制探讨

目的采用生物信息学方法分析术后认知功能障碍(POCD)小鼠海马组织中差异表达miRNA(DEMs)及其靶基因(DEGs),并构建POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA-mRNA的调控网络图,探讨其机制。方法在GEO数据库中搜索下载POCD小鼠海马组织与正常小鼠海马组织基因表达谱芯片数据GSE95070,采用R软件lim⁃ma函数包筛选出差异表达的miRNA,即DEMs。将DEMs分别输入到miRTarBase、TargetScan、miRDB数据库中,三个数据库中皆存在的靶基因为差异表达的DEMs靶基因,即DEGs。使用R软件中的ggplot2、enrichplot函数包对DEGs进行了基因本体(GO)功能富集分析和KEGG信号通路分析。通过STRING在线工具构建DEGs蛋白互作网络(PPI),将蛋白间相互作用得分>0.4的节点输入到可视化工具Cytoscape软件中,利用cytoHubba插件筛选出节点度值排名前10的节点,即为可能参与小鼠POCD发生发展的枢纽基因。选取枢纽基因及其相应的DEMs,利用Cyto⁃scape软件构建POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA-mRNA调控网络图。结果共筛选出19个显著差异表达的DEMs,得到448个DEGs。GO功能富集分析结果显示,DEGs在DNA结合的转录因子激活活性、特异性RNA聚合酶Ⅱ、微小GTP酶结合等分子功能中显著富集,在树突的形成以及调节、促进神经胶质细胞的增殖等生物学过程中显著富集,在突触膜的有机组成成分、细胞边缘以及囊泡运输等细胞组分中显著富集。KEGG信号通路分析结果显示,DEGs在Cushing综合征相关通路、cGMP-PKG信号通路、Hepatitis C信号通路、Apelin信号通路等通路中显著富集。小鼠POCD发生发展的10个枢纽基因分别为Gsk3β、Igf1、Cd34、Ubxn7、Smad2、Smarca4、Stat1、Grb2、Sin3a、Ncam1,相应的6个DEMs分别为mmu-miR-362-3p、mmu-miR-3065-5p、mmu-miR-592-3p、mmu-miR-28a-3p、mmu-miR-181c-5p、mmu-miR-351-5p,成功构建了POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA-mRNA调控网络图,其中mmu-miR-362-3p调控Gsk3β的关系对、mmu-miR-3065-5p调控Igf1的关系对在调控网络中节点度最高。结论与正常小鼠海马组织相比,POCD小鼠海马组织中有19个差异表达的DEMs和448个DEGs;DEGs与树突的形成以及调节等有关,参与介导Cushing综合征相关通路、cGMP-PKG信号通路等。mmu-miR-362-3p、mmu-miR-3065-5p等差异表达的miRNA可能是通过调节Gsk3β、Igf1等靶基因的表达,影响POCD的发生发展。