大理野茄M239响应黄萎病病菌侵染的差异表达蛋白分析

为了探索植物响应黄萎病病原菌侵染的作用机制,以黄萎病高感野茄材料大理野茄(M239)为研究对象,通过人工接种黄萎病病原菌大丽轮枝菌的方法,首先测定M239在接种大丽轮枝菌后0,6,12,24,48 h的根部4个关键生理指标,即过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性和可溶性蛋白(SP)含量的变化。结果确定接种大丽轮枝菌后12,24 h为蛋白组分析取样的关键时间点;在此基础上,利用iTRAQ技术分析M239在接种大丽轮枝菌后根部蛋白的变化。结果发现,与清水接种(CK)相比,M239接种大丽轮枝菌后12 h有463个差异表达蛋白(DEPs),其中305个下调,158个上调;接种后24 h,有456个DEPs被病原菌诱导表达,包括296个下调,160个上调。这些蛋白主要富集在碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、次生代谢物的生物合成、丙酮酸代谢、新陈代谢等途径。通过与已报道的黄萎病抗性材料的研究结果进行对比分析发现,M239在响应大丽轮枝菌的侵染过程中,参与防御响应的蛋白数量和代谢通路较少,未能形成有效的防御网络,最终表现为感病。

原料乳冷藏过程中差异表达蛋白的表征与比较分析

采用数据独立采集蛋白质组学技术分析4℃冷藏6 d的原料乳差异蛋白质组成及其生物学功能。冷藏过程中,共鉴定到902种蛋白质。其中,冷藏前期(d 0 vs d 3)和冷藏后期(d 3 vs d 6)分别筛选出70种和71种差异表达蛋白。生物信息学分析发现冷藏前期差异蛋白具有对神经生长因子的刺激反应和细胞组织的调控等功能,主要参与了细胞的生物学过程;冷藏后期差异蛋白具有碳水化合物代谢过程和RNA代谢过程的调节等功能,主要参与了糖代谢途径。蛋白-蛋白互作网络分析表明,细胞分裂控制蛋白42同源物(CDC42)是两个冷藏阶段共有的关键节点蛋白,该蛋白与细胞的吞噬作用密切相关。上述结果揭示了冷藏过程中的蛋白质组成差异和功能的多样性,为原料乳的冷藏提供了理论依据,对原料乳的质量控制具有重要意义。

炎症性肠病合并皮肤损害患者外泌体差异表达蛋白质及发病机制研究

目的探讨炎症性肠病(IBD)合并皮肤损害患者外泌体差异表达蛋白质及发病机制。方法选取杭州市第三人民医院2020年1月至2021年12月收治的5例IBD以及5例IBD合并皮肤损害患者为研究对象,分别为IBD组、IBD+皮肤损害组;另选取本院同期体检的5名年龄和性别匹配的健康志愿者为对照组。提取3组对象血清外泌体,检测差异表达蛋白质;采用基因本论(GO)和京都基因和基因组数据库(KEGG)对差异表达蛋白质进行生物信息学分析。结果共鉴定829种蛋白质,其中包含定量信息的蛋白质726种。与对照组比较,IBD组有15种蛋白质表达上调,21种蛋白质表达下调;IBD+皮肤损害组有24种蛋白质表达上调,25种蛋白质表达下调;与IBD组比较,IBD+皮肤损害组有12种蛋白质表达上调和8种蛋白质表达下调。GO分析显示,IBD组与对照组、IBD+皮肤损害组与对照组、IBD+皮肤损害组与IBD组差异表达蛋白质涉及的生物过程包括刺激反应、细胞过程、单有机过程、生物调节等,细胞组成主要包括细胞、细胞膜外域、细胞器等,分子功能主要包括结合、催化活性等。KEGG分析显示,IBD组与对照组差异表达蛋白质主要与细胞黏附、离子跨膜运输调控、细胞形态分化等有关;IBD+皮肤损害组与对照组差异表达蛋白质主要与细胞分泌、细胞分解代谢、分泌调节有关;IBD+皮肤损害组与IBD组差异表达蛋白质主要与细胞胺代谢、NIK/NF-κB信号通路、细胞周期过程的负调控等有关。结论本研究基于TMT蛋白质组学分析筛选出IBD+皮肤损害患者血清外泌体差异表达蛋白质,这些蛋白质参与IBD合并皮肤损害的代谢相关通路及病变的发生。

基于整合分析基因表达数据筛选急性胰腺炎中差异表达基因

目的了解急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的生物学和分子发病机制,为预防和治疗AP提供依据。方法从基因表达总库数据库获取基因表达数据集GSE109227、GSE3644和GSE65146,其中包括AP小鼠和对照小鼠胰腺样本的基因表达谱。使用GEO2R鉴定所有差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并使用基因本体(gene ontology,GO)和京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析进行注释。结果在GSE109227、GSE3644和GSE65146数据集中发现38个共同的DEGs,将其构建成1个蛋白质-蛋白质相互作用(protein-proteininteraction,PPI)网络,确定了枢纽蛋白,并提取了功能模块。通过PPI网络分析确定参与粘连接头通路的3个基因(Cdh1、Iqgap1和Actn4),可能为AP的诊断和治疗提供潜在的生物标志物。结论Cdh1、Iqgap1和Actn4基因对AP的发生和发展有影响,这可能为AP的诊断和治疗提供新的靶点。

铁蓄积大鼠食管黏膜组织差异表达基因的筛选及生物学功能分析

目的筛选铁蓄积大鼠食管黏膜组织差异表达基因,并分析差异表达基因的生物学功能。方法12只6周龄雄性SD大鼠随机分为铁蓄积组和对照组,每组6只,铁蓄积组隔天腹腔注射蔗糖铁溶液制备铁蓄积模型,对照组注射等量生理盐水,14周后取血和食管、肝等组织,应用血清学、组织学方法鉴定铁蓄积造模是否成功;剥离两组食管黏膜组织,采用转录组测序技术筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行基因本体(GO)功能富集分析及真核生物蛋白相邻类的聚簇(KOG)分类富集分析。结果筛选出9个差异表达基因,5个上调基因包括昼夜相关转录抑制因子(Ciart)、液泡蛋白质分选因子25(Vps25)、甲状腺激素应答蛋白(Thrsp)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶1(Uap1)、血清解整合素—金属蛋白酶33(Adam33),4个下调基因包括过氧化物酶基因(Pxdn)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因2(Hspg2)、中心体相关蛋白2(Cep2)、G蛋白信号转导调节因子4(Rgs4)。GO功能富集分析显示,上调基因的生物过程(BP)集中在节律过程、代谢过程、行为、生物过程调节、特定位置运动、生物过程的负调控、生物调节、定位、细胞过程、多细胞生物过程;细胞组成(CC)主要集中在膜封闭腔、细胞器部分、细胞器、膜、细胞外区域部分、膜部分、细胞部分、细胞;分子功能(MF)主要集中在结合、结构分子活性、催化活性。下调基因的BP主要集中在解毒、刺激反应、细胞组成或生物形成、信号、生物过程的负调控、生物过程的正调节、发育过程、细胞过程、生物过程调节、生物调节、代谢过程;CC主要集中在细胞外基质、细胞外基质组成、细胞外区域部分、细胞外区域、细胞器、膜、细胞部分、细胞;MF主要集中在酶调节活性、抗氧化活性、分子功能调节剂、受体调节活性、结构分子活性、结合、催化活性。KOG分类富集分析显示,表达上调的基因中有3个获得功能注释,Uap1被注释到细胞壁/膜/包膜生物形成,Adam33被注释到翻译后修饰,蛋白质折叠和伴侣蛋白,Vps25被注释到功能预测。表达下调的基因中有2个获得功能注释,Rgs4被注释到信号转导机制,Hspg2被注释到翻译后修饰,蛋白质折叠和伴侣蛋白。结论铁蓄积大鼠食管黏膜组织中共筛选出9个差异表达基因,包括5个表达上调基因和4个表达下调基因。GO功能富集分析显示差异表达基因主要参与的BP包括节律过程、代谢过程、细胞过程、生物过程调节等,主要参与的CC包括细胞器、膜、细胞外区域部分等,主要参与的MF包括结合、催化活性、结构分子活性。有5个差异基因获得KOG功能注释,包括翻译后修饰、蛋白质折叠和伴侣蛋白、信号转导等,主要参与细胞周期、细胞代谢、细胞增殖及氧化应激等通路。

SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1表达在三阴性乳腺癌组织中的临床意义

目的探讨分泌性卷曲相关蛋白4(SFRP4)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、DEP结构域蛋白1B(DEPDC1B)、程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)在三阴性乳腺癌(TNBC)组织中表达意义。方法选取83例TNBC患者作为研究对象,均于术中采集肿瘤组织及癌旁正常组织,采用免疫组化SP法检测SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1表达情况,比较肿瘤组织及正常组织内上述表达情况;并分析SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1表达与患者年龄、绝经状态、肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤分期等病理特征的关系。结果肿瘤组织内SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1阳性表达率高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05);SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1阳性表达患者肿瘤直径≥3 cm、临床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移占比高于SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1阴性表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论SFRP4、HMGB1、DEPDC1B及PD-L1在TNBC组织内存在较高表达,且高表达与肿瘤分期、淋巴结转移关系密切,可用于指导临床完善治疗方案。

显微介导中国对虾基因鲤肌肉蛋白差异表达分析

本文通过显微注射方法,将中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)总DNA直接导入鲤(Cyprinus carpio L.)受精卵内,获得显微介导中国对虾基因鲤。为了研究显微介导中国对虾基因鲤蛋白质的表达变化,利用iTRAQ技术定量蛋白质测序分析了未进行显微介导和显微介导中国明对虾基因的2种鲤的肌肉组织,寻找与氨基酸和脂肪酸相关的差异表达蛋白,并分析了差异表达蛋白GO功能注释和KEGG代谢通路。结果共鉴定蛋白质999个,表达差异蛋白92个,其中上调蛋白58个,下调蛋白34个。差异蛋白Pathway富集分析表明,显著富集于脂肪酸和氨基酸等代谢通路上的差异蛋白有13个,其中在精氨酸和脯氨酸代谢通路中发现的上调7.51倍的肌酸激酶(creatine kinase)有促进鱼类肌肉发育的作用;而在脂肪酸代谢通路中发现的下调0.59倍的线粒体三功能蛋白(mitochondrial trifunctional protein),有提高鱼体内多种饱和与不饱和脂肪酸含量的作用。同时对筛选到的两个蛋白进行实时荧光定量PCR验证,证实了蛋白质组的分析结果。

应用非标记定量蛋白组学研究帕金森病差异表达蛋白

目的寻找帕金森病(PD)患者血清中差异表达的蛋白,探索PD生物学标志物。方法选择在北京医院临床确诊的PD患者24例,其中12例为仅有PD病史(P1组),另12例合并有高血压病、糖尿病基础疾病(P2组);筛选24例年龄、性别匹配的体检者(对照组C1和C2组),采集血清标本去除高丰度蛋白后,应用非标记定量蛋白组学技术检测各组血清中蛋白表达,采取双重对比将P1组与C1组、P2组与C2组比较,分别筛查出差异表达蛋白,再从中筛选出表达变化(上调或下调)一致的蛋白,确定为PD差异表达蛋白,并用生物信息学方法分析解释。结果各组对比后,共鉴定出4种差异表达的蛋白为PRG4、CFHR-3、ACTG1、HIST2H2BF,其中PD患者的血清中PRG4、CFHR-3表达上调,ACTG1、HIST2H2BF表达下调且存在一定的相互作用。结论应用非标记定量蛋白组学筛选出了帕金森差异表达的蛋白,可能对帕金森病的诊断具有一定的意义。

意大利蜜蜂防御素-2蛋白序列分析及表达特性研究

【目的】对意大利蜜蜂(Apis mellifera)防御素-2蛋白(Defensin-2,Def-2)进行蛋白序列分析和表达特性研究,以期为意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御机制、发育和代谢途径研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学在线网站及软件对Def-2蛋白进行预测分析,并采用实时荧光定量PCR对意大利蜜蜂不同发育时期(幼虫期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂)的基因相对表达量进行检测分析。【结果】意大利蜜蜂防御素-2基因(Def-2)编码104个氨基酸残基,相对分子量为11858.90 Da,理论等电点(pI)为8.54,为两性不稳定蛋白。该蛋白N-末端有一段含21个氨基酸的信号肽,存在1个跨膜结构域,亚细胞主要定位于内质网、液泡和高尔基体,无糖基化位点,存在15个磷酸化位点,其二级结构以无规卷曲(54.81%)为主、延伸链(28.85%)分布较多,α-螺旋(16.35%)分布较少,蛋白序列高度保守,与Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd等蛋白存在基因互作关系,具有防御蛋白样结构域(DEFL),结构域采用以半胱氨酸稳定的α/β支架为特征的结构,亲缘关系与小蜜蜂极为相近。Def-2基因在意大利蜜蜂不同发育时期的表达水平存在差异且随日龄增大而升高,30 d的相对表达量显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】意大利蜜蜂Def-2蛋白属于两性不稳定蛋白,参与细胞间信号传输并维持细胞正常形态;蛋白序列高度保守,亲缘关系与小蜜蜂最近,且该基因在30 d成年期工蜂中高丰度表达,推测其可能调节免疫基因转运而影响蜜蜂的免疫识别过程。

动物品种间免疫球蛋白基因表达谱及其多样性形成机制研究进展

免疫球蛋白(immunoglobulins,Igs)是存在于人和动物血清、组织液及其他外分泌液中的一类具有抗体性质的球蛋白,是构成免疫防御的重要组成部分。研究普遍认为免疫球蛋白基因在物种进化中相对保守,但近几年的研究发现,Ig基因多样化的特征在同一物种不同品种以及生物体不同发育水平中存在差异。IgV基因的种系变异可能具有功能效应,故不同动物品种Ig基因的内在多态性以及多样化表达机制在一定程度上也影响着机体的抗病能力。论文综述了目前已知的同一物种不同品种的免疫球蛋白重链和轻链可变区基因及其多样化表达机制的差异,以期为相关动物的抗病育种和免疫学研究提供参考依据。

子痫前期差异表达基因的筛选和生物信息学分析

目的:筛选子痫前期胎盘组织差异表达基因并行生物信息学分析,探索子痫前期的发生机制。方法:在基因表达综合数据库中筛选出GSE10588、GSE25906和GSE74341三个数据集,GEO2R法筛选出子痫前期组和正常妊娠组胎盘组织的差异表达基因,使用DAVID数据库对其进行基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,通过STRING网站及Cytoscape软件构建蛋白质的相互作用(PPI)网络并进行可视化,筛选关键基因。结果:共筛选出255个差异表达基因,其中120个基因表达上调,135个基因表达下调。进一步筛选出前10个关键基因:RHOA,CXCR4,RPL7A,RPL6,CXCL12,MRPS12,PLEC,MAPK1,DDX5,ITGB1。GO分析显示,在生物学过程组中,基因主要富集于细胞黏附、细胞分化、趋化因子、细胞迁徙等;在细胞组分组中,基因主要富集于黏着斑、外泌体、细胞黏附等;在分子功能组中,基因主要富集于细胞黏附。KEGG通路富集分析提示基因主要富集于白细胞迁徙、趋化因子信号通路、血小板激活、黏着斑等。结论:本研究通过生物信息学方法发现细胞黏附、细胞骨架、外泌体、趋化因子等因素参与子痫前期的发生,为子痫前期发生机制的进一步研究和药物靶点、标志物的筛选提供了基础。

iTRAQ技术在颅内动脉瘤病人血浆差异表达蛋白检测中的应用

目的探讨同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术在颅内动脉瘤血浆差异表达蛋白(DEPs)检测中的应用价值。方法收集2019年1~12月收治的10例颅内破裂动脉瘤病人血浆10份,同时收集年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压以及动脉瘤位置等相匹配的10例颅内未破裂动脉瘤血浆10份作为对照组。采用iTRAQ技术筛选血浆样本DEPs,应用生信分析方法GO分析和KEGG通路富集分析,并与GEO数据库的数据集进行交叉验证。结果经蛋白质组学分析鉴定出806个可定量蛋白,其中DEPs共122个,表达上调59个,表达下调63个。GO和KEGG分析结果显示,动脉瘤破裂主要与炎症和免疫反应相关。DEPs相互作用网络分析显示,白蛋白、血红蛋白β亚基、钙调蛋白1、转铁蛋白和载脂蛋白A1是网络核心蛋白。与GEO数据集交叉结果显示,血浆样本SLMAP、IQGAP3、PTPRJ、PEBP1、S100P、BASP1和AOC3等表达水平与GEO数据集的动脉瘤组织基因表达水平呈现相同变化趋势,而且破裂动脉瘤与未破裂动脉瘤之间具有统计学差异(P<0.05)。结论本文结果初步筛选出与颅内动脉瘤破裂相关的血浆DEPs,这些DEPs与炎症和免疫反应密切相关。这为研究颅内动脉瘤发病的分子机制和潜在的治疗靶点提供了新的线索。

半乳糖凝集素1在退变椎间盘中的差异表达

背景:半乳糖凝集素1调控诸多组织、器官的生理病理过程,其与椎间盘退变的关系尚不明确。目的:分析半乳糖凝集素1在不同退变程度椎间盘中的差异性表达,并探讨其对大鼠椎间盘退变的影响。方法:收集新疆医科大学第一附属医院15例患者的椎间盘标本,采用Pfirrmann分级后检测半乳糖凝集素1在不同退变程度椎间盘中的差异性表达。建立SD大鼠腰椎退变模型,随机分为3组,造模后隔日进行干预,对照组、模型组分别尾静脉注射生理盐水,半乳糖凝集素1干预组尾静脉注射半乳糖凝集素1重组蛋白,1次/d,各组均干预7 d;造模术后8周使用Bruker Pharmascan 7.0T核磁共振仪进行Pfirrmann分级后观察椎间盘的病理变化,并检测椎间盘中半乳糖凝集素1、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达。结果与结论:①qRT-PCR、免疫组织化学染色及Western Blot结果提示随着椎间盘退变的加重,半乳糖凝集素1表达逐渐减少,3组之间比较差异有显著性意义(P<0.05);②术后8周,大鼠腰椎MRI提示半乳糖凝集素1干预可降低改良Pfirrmann分级;苏木精-伊红染色提示半乳糖凝集素1干预减少椎间盘退变的病理改变;免疫组化及Western blot结果提示半乳糖凝集素1干预在增加椎间盘中半乳糖凝集素1表达的同时减少Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的降解,3组之间相比差异有显著性意义(P<0.05);③结果提示随着椎间盘退变程度的加重半乳糖凝集素1表达逐渐减少;半乳糖凝集素1干预可以延缓大鼠椎间盘针刺退变模型的进展。

黄萎病菌侵染下陆地棉Dirigent-like蛋白基因表达差异分析

目的发掘陆地棉Dirigent-like蛋白基因家族,明确不同黄萎病抗性品种间该基因家族成员的多态性及表达差异。方法利用Illumina Hiseq 2000测序平台,通过RNA-Seq测序技术,获得黄萎病菌侵染陆地棉抗病品种和感病品种的Dirigent-like蛋白基因家族成员Unigene序列;采用生物信息学软件对其进行核苷酸序列及编码蛋白的多重比对和系统进化分析;针对该家族成员设计特异的quantitative real-time PCR引物,在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System上使用SYBR green PCR试剂盒标记反应产物,棉花Gh ACTIN为内标,采用2-ΔΔCt法分析抗病品种冀79、感病品种TM-1中该基因家族成员在0 h及受侵染1、8、24、48、72和96 h后的表达差异。结果获得12个陆地棉Dirigent-like蛋白基因家族成员;该家族成员分属3个进化群,基因间存在4个保守结构域。其同源基因在D5基因组染色体上,主要集中于第2、3、6、7、9、10、13染色体。陆地棉受黄萎病侵染后,Dirigent-like蛋白基因抗病、感病品种间差异表达,抗病品种冀79受黄萎病菌侵染1 h时上调2倍以上的有Gh DIR4、Gh DIR6、Gh DIR7、Gh DIR9、Gh DIR10和Gh DIR11,其中,Gh DIR9上调6.5倍;侵染8 h时Gh DIR1、Gh DIR4、Gh DIR7和Gh DIR11上调,有2个上调2倍以上;侵染24 h时仅Gh DIR4上调2倍以上;侵染48 h时Gh DIR1、Gh DIR4、Gh DIR7和Gh DIR11上调达到2倍以上;侵染72 h时仅Gh DIR9上调2倍以上,达到6.4倍;侵染96 h时仅Gh DIR4上调2倍以上。感病品种TM-1受侵染1 h时仅Gh DIR7上调2倍以上;受侵染8 h时Gh DIR7上调325倍,Gh DIR10上调2倍以上;侵染24和48 h时Gh DIR4、Gh DIR5、Gh DIR6、Gh DIR7、Gh DIR9、Gh DIR10急剧上调,Gh DIR7、Gh DIR9、Gh DIR10上调10倍以上;受侵染72 h时Gh DIR4和Gh DIR7还保持较高的表达量;侵染96 h时Gh DIR5、Gh DIR6、Gh DIR7、Gh DIR9、Gh DIR10和Gh DIR11保持较高的表达量。由此看出,受黄萎病侵染时抗病种质冀79 Dirigent-like蛋白基因家族成员上调表达要早于感病品种,但是,该基因家族成员在感病品种受侵染8 h后上调倍数远远高于抗病品种,而且到96 h时其表达量还较高;抗病品种上调的Dirigent-like蛋白家族成员Gh DIR4、Gh DIR7、Gh DIR9和Gh DIR11值得关注;Gh DIR6、Gh DIR7、Gh DIR9和Gh DIR10在感病品种TM-1中上调显著。此外,抗病、感病品种间Gh DIR1、Gh DIR3、Gh DIR5、Gh DIR8、Gh DIR10和Gh DIR12存在核苷酸多态性。结论 Dirigent-like蛋白与黄萎病菌侵入后棉花植株的抗性反应相关。

筛选差异表达基因和蛋白质的方法进展

分离和鉴定差异表达基因和蛋白质不仅有助于发现基因和蛋白质的功能 ,更有助于揭示某些疾病的发生机理 .目前筛选差异表达基因的方法主要有差异显示PCR方法 (differentialdisplayRT PCR ,DDRT PCR)、消减杂交法 (subtractivehybridization ,SH )、基因芯片技术 (DNAchiptechnique)和基因表达的系统分析 (serialanalysisofgeneexpression ,SAGE)等 ,其中消减杂交法中又先后建立了代表性差异分析技术 (representationaldifferenceanalysis ,RDA)、抑制消减杂交法 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)和获得全长基因的消减杂交法 (full length gene obtainablesubtractivehybridization) .筛选差异表达蛋白质的方法主要有双向电泳技术(two dimentionalgelelectrophoresis)和噬菌体全套抗体库技术 (phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique) .这些方法各有特点 ,各有利弊 ,研究者可根据自己的需要选择适合于自己的方法 .

茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析

【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1110个茶树花蕾cDNA片段中,122个(10.9%)是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因(GenBank登录号:DQ444463),其全长为1072bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。

应用iTRAQ结合质谱技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白

目的:应用同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ)结合质谱技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白。方法:将30只健康SPF级雄性Wistar大鼠随机分为冷应激组A和常温饲养组B,将A、B两组分别随机分为3组,即A1、A2、A3组和B1、B2、B3组(n=5)。常温饲养温度为(24.0±0.1)℃,冷应激温度为(4.0±0.1)℃。两组实验大鼠经不同温度处理12 h后,用肝素钠抗凝负压管腹主动脉采血,分离血浆,提取血浆蛋白、定量、酶解、iTRAQ标记、强阳离子交换色谱(SCX分离)和质谱分析。结果:共鉴定出1 085个蛋白,筛出39个差异表达蛋白,其中29个表达上调蛋白,10个表达下调蛋白。经生物信息学分析,筛出3个与动物冷应激相关的重要差异表达蛋白,分别为:组织相容性蛋白HA-1、Ras相关蛋白Rap1b、整合蛋白β-1。结论:本实验成功筛出冷应激大鼠血浆差异表达蛋白,iTRAQ技术为筛选大鼠冷应激蛋白诊断标志物提供了一个良好的平台,为深入研究动物冷应激发生机制奠定了良好基础。

正常精子和圆头精子差异表达蛋白的分离与鉴定

圆头精子症是一种表现为顶体缺失的男性不育症.为了研究正常精子和圆头精子的蛋白质组成差异,用固相pH梯度双向凝胶电泳和质谱分析等蛋白质组学方法,分离了 30份正常和 3份圆头精子标本的蛋白质.对其中16个在正常精子中有高丰度表达而在圆头精子中缺失,和 1个在圆头精子中表达明显下调的蛋白质点,以及在圆头精子中存在而在正常精子中缺失的蛋白质簇W和点X,进行了肽质指纹分析和蛋白质鉴定,获得 8个点的肽质量指纹图,经MS Fit软件搜索SWISS PROT数据库来鉴定其身分.发现其中 3个点与高尔基体相关、2个点与蛋白酶体相关、2个点为锌指蛋白。

低温胁迫下苦瓜幼苗差异蛋白的表达与分析

【目的】寻找与苦瓜苗期耐低温表达调控相关的蛋白,深入了解苦瓜抗低温机理,为下一步开展苦瓜耐低温分子基础研究及苦瓜耐低温育种打下基础。【方法】以耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品种为材料,运用双向电泳技术分析低温胁迫(8℃低温胁迫72 h)下苦瓜苗期叶片蛋白质差异变化。【结果】对2-DE图谱分析发现,冷敏型MC6和耐冷型MC108苦瓜品种间共存在82个差异蛋白点,其中,39个蛋白点上调,36个蛋白点下调,2个新增蛋白点,5个消失蛋白点;对其中24个表达量变化明显的蛋白质点进行MALDI-TOF-TOF/MS分析,经数据库搜索匹配,鉴定出5个未知蛋白和14个功能蛋白,这些蛋白涉及细胞防御、自由基清除、光合作用、基础代谢、蛋白降解等多个功能类别。【结论】在逆境胁迫下苦瓜可通过调节多种蛋白表达来适应外界温度的变化。

不同配穴针刺预防应激性胃溃疡的效应比较及差异表达蛋白的筛选

目的:观察不同配穴的预防性针刺对应激性胃溃疡大鼠胃组织损伤情况及蛋白质谱的影响,阐明不同配穴针刺预防应激性胃溃疡效果,获得相关差异表达蛋白。方法:120只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、捆绑对照组、应激性胃溃疡模型组、募穴组、下合穴组、合募配穴组、背俞穴组和俞募配穴组,每组15只。各组大鼠针刺后采用水浸-束缚法制备应激性胃溃疡模型,观察各组大鼠胃黏膜损伤形态学表现,计算溃疡指数;提取胃组织蛋白,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对胃组织匀浆上清液中的蛋白进行梯度分离,采用纳升级电喷雾高效液相仪联合LTQ线性离子阱质谱仪(Eksigent-Thermo LTQ-MS)检测蛋白表达水平。结果:合募配穴组大鼠溃疡指数低于募穴组、下合穴组、背俞穴组和俞募配穴组(P<0.05)。筛选出的感兴趣差异表达蛋白有以下几种:①酶类,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、碳酸酐酶1(Car1)、碳酸酐酶3(Car3)、乌头合酶(Aco2)、α-烯醇化酶(Eno1)、β烯醇化酶(Eno3)和γ烯醇化酶;②运动(骨架)蛋白质,包括alpha 1肌动蛋白(Actc1)、β肌动蛋白(Actb)、α肌动蛋白(Acta1)和相对分子质量为43 000的蛋白质(Actg2);③运输蛋白质,包括血清铁传递蛋白(TF亚型1)和钙网蛋白(Calr);④热休克蛋白,包括相对分子质量为10 000的热休克蛋白(Hspe1)。结论:合募配穴预防应激性胃溃疡效果优于单穴组及俞募配穴组,机制可能与多种蛋白的表达变化有关。