一个在肺腺癌细胞系中差异表达cDNA片段的定位及表达分析

为了研究和克隆肺癌转移相关候选基因 ,探讨肺癌发生及转移的分子基础 ,应用细胞培养、cDNA克隆、North ern印记杂交和生物信息学技术分析了在细胞来源相同 ,但转移能力不同的肺腺癌细胞系AGZY83 a和Anip973中差异表达片段OPB7 1在人不同组织中和不同人肺癌细胞系中的表达情况 ,并应用RH定位技术对该片段进行了基因定位。表明OPB7 1与已知基因同源性差 ,该基因在正常人多种组织中有表达 ,心肌和骨骼肌中高表达 ,转录本均为 3 0kb左右。在不同人肺癌细胞系中存在该基因的表达差异 ,高转移潜能、低分化及高浸润的细胞系中呈高表达趋势 ,且表达的片段大小略有差别。提示OPB7 1是一个具有广泛表达谱的基因 。

水稻矮化突变体差异表达cDNA片段的克隆与分析

利用抑制性消减杂交 (Suppressivesubtractionhybridization ,SSH)分离本实验室获得的一株水稻矮化突变体dwarf6 9与其野生型对照品系特光矮_2 (Oryzasativa ,TGA_2indica)间表达有差异的cDNA片段 .分别以dwarf6 9作为驱赶子 ,TGA_2为检测子 ,以及以dwarf6 9作为检测子 ,TGA_2为驱赶子建立了两个差异表达cDNA文库 ,分别代表在TGA_2和dwarf6 9中特异表达的cDNA .经反式Northern检测这两个文库共得到

利用cDNA-AFLP技术研究茶树花蕾发育基因差异表达片段

利用cDNA-AFLP技术,对茶树花蕾发育期的基因表达进行了分析。结果表明,茶树花蕾在发育早期和晚期基因的表达中有明显差异,共显示1110条带,早期发育花蕾和晚期发育花蕾显示的特异条带分别为35条和87条;选取特异表达的晚期发育花蕾重复性较好的15个TDFs(Transcript Derived Fragment)在GenBank进行序列分析,结果显示,9个分别与氧化还原酶、染色体13、14-3-3蛋白、Amyrel基因、钙网蛋白、ATP硫化酶、接触反应/铁离子结合蛋白及花粉特异蛋白的序列有相似性;2个与假拟蛋白相似,4个在GenBank数据库中未找到相似序列。

小麦抗黄矮病相关基因cDNA-AFLP差异表达片段的验证

cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达的有利工具,广泛用于植物抗病、抗逆和生长发育等研究领域。本研究以cD-NA-AFLP技术分离的抗黄矮病小麦与感黄矮病小麦间差异表达片段为对象,利用反向Northern方法,从cDNA-AFLP技术筛选的46个候选抗黄矮病防御基因差异表达片段中,筛选出抗黄矮病相关防御基因片段6个;采用对回收的差异片段进行再扩增(延伸引物再扩增),再与原选扩产物一起进行PAGE电泳分析法,并结合半定量RT-PCR分析法,又验证了候选抗黄矮病相关基因表达片段3个。反向Northern方法以及对回收的差异片段进行再扩增(PAGE再分析法),结合(半)定量RT-PCR分析方法,可以比较准确地验证cDNA-AFLP所筛选出的基因差异表达片段。

利用单酶切cDNA-AFLP技术分离玉米对生性状相关基因差异表达片段

为了深入地研究对生玉米这一珍贵的高产育种种质资源和植物形态发育突变材料形成的分子机理和调控机制,通过构建合适的玉米对生、互生近等基因系总RNA池,首次采用改进的单酶切cDNA-AFLP技术,对扩增的玉米对生性状相关基因的差异表达片段进行筛选、分离和生物信息学分析。结果共获得29条差异表达片段:对生玉米增强表达23条、抑制表达6条。选取其中5条(STT-TT、STT-TC、STT-CC、STT-GC、SCT-TG)增强表达片段进行克隆和测序,序列同源性分析表明:STT-GC与烟草细胞色素b5基因有80%的同源性、SCT-TG与玉米、牛筋草、大麦、狗尾草、水稻等的α-微管蛋白基因有90%以上的同源性。实验证明:单酶切cDNA-AFLP技术是一种研究玉米基因差异表达的实用方法。

N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定

运用ｍＲＮＡ差异显示（ＤＤ－ＰＣＲ）技术，通过２６对锚定及任意引物组合显示基因的差异表达情况，分离了７个表达有差异的片段．其中３个片段的相关基因属于对Ｎ－甲基－Ｎ′－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）处理的初级反应基因，２个属于次级反应基因．另有２个片段的差异表达仅在蛋白合成抑制剂环己亚胺（ＣＨＭ）合并ＭＮＮＧ处理时才出现．反向缝隙印迹杂交分析印证了２个片段在ＤＤ－ＰＣＲ中发现的改变，同时分析的本实验室分离的２５个片段中，８个片段的变化被验证与ＤＤ－ＰＣＲ中的改变一致．序列分析结果显示这些片段与许多基因有高同源性，其中包括一些参与信息传导的基因．

Tenebrio molitor抗冻蛋白基因家族cDNA片段的克隆、序列分析及原核表达

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法,克隆黄粉甲虫(Tenebriomolitor)抗冻蛋白基因cDNA片段并进行序列分析和原核表达。同源性分析表明,获得9条新cDNA片段,与黄粉甲虫抗冻蛋白基因家族的其他基因序列具有较高的同源性。重组质粒pGEX-4T-1-tmafp-XJ430,转化E.coliBL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,抗冻蛋白基因以可溶性融合蛋白表达,相对分子量为38kDa。构建真核表达载体pCDNA3-tmafp-XJ430,免疫小鼠,获得的抗血清滴度为1:2000。Westernblotting结果为单一的条带,证明该抗血清具有针对抗冻蛋白TmAFP-XJ430抗原的专一性。

利用cDNA-AFLP技术分析玉米自交系黄早四甘蔗花叶病毒侵染后基因差异表达

本文以国内广泛应用的抗甘蔗花叶病毒玉米自交系黄早四为材料,利用cDNA-AFLP差异显示方法,分析其接种病毒后的基因表达差异模式。用56对引物扩增出203个基因差异显示片段,其中187个是诱导性表达,16个是抑制性表达。经反向Northern确认随机挑选的24个基因差异片段中有11个是病毒侵染后诱导表达的,其中有10个片段在GenBank数据库中可以找到显著同源序列,这些基因差异显示片段分别与玉米磷酸丙糖转移蛋白(TPT)、转录调节因子、G蛋白、锌指结构域、果糖1,6-二磷酸酶、芳烃受体等基因有较高同源性。

高温胁迫下番茄叶片差异表达基因的cDNA-AFLP分析

为鉴定番茄高温胁迫响应基因,应用cDNA-AFLP技术,以番茄耐热品系Saladette幼苗为研究对象,对高温胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过768对引物组合的筛选,共分离得到187个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或高温胁迫下特异性表达TDF153条,抑制表达34条。对其中47个TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明:34个TDF与NCBI或TIGR已有序列同源(E-Value<10-5),功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有13个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。

人参植物与皂苷生物合成相关的差减cDNA文库构建及基因差异表达分析

应用抑制差减杂交技术,分别以源于4年和1年生人参根组织cDNA群体作为检测子(tester)与驱赶子(driver),成功构建了与人参植物皂苷生物合成相关的差减cDNA文库,并对从中筛选的阳性cDNA克隆进行DNA测序及其序列分析、PCR及Northern印迹杂交鉴定.结果显示,获得的13个克隆为新基因序列.其中6个差减克隆系人参植物根生长发育阶段差异表达基因.目前,6个差异表达新基因的结构与功能仍在进一步研究中.

利用斑茅cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达

为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制,利用斑茅干旱胁迫cDNA芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达。经杂交,在cDNA芯片的3860个模板中,有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为101个,其中上调55个,下调46个。部分基因的定量PCR验证表明,芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除,一共获得36个uniqueESTs。已知功能的22个上调表达基因,涉及多条生理代谢途径,如光合作用、离子转运和核酸代谢途径;以及多种分子水平的进程,如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外,还检测到14个未知功能基因。结果表明,甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达及其网络构建奠定了基础,还为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。

肺癌差异表达cDNA序列的分离与鉴定

背景与目的:肺癌癌变的分子机理至今还不很清楚,其关键是未找到与肺癌密切相关的基因。本研究拟分离和鉴定肺癌差异表达cDNA序列,为进一步克隆肺癌相关基因打下基础。方法:采用mRNA差异显示、克隆、反向点杂交、测序和Reversetranscription-PCR(RT-PCR)方法分离在肺癌组织和肺癌细胞系中表达下调或不表达,以及在肺癌组织和肺癌细胞系中过表达的差异cDNA序列。结果:mRNA差异显示获得16条差异的片段。将差异片段进行克隆、反向点杂交、测序、同源性比较,共获得10条不同的cDNA序列。其中2条为新基因,8条与已知基因高度同源。进一步RT-PCR证实LXDD1、LXDD2两条cDNA序列在肺癌及正常肺支气管粘膜组织中存在差异表达。结论:运用mRNA差异显示,成功分离了10条差异表达cDNA序列,并证实其在肺癌及正常肺支气管粘膜组织中存在表达差异。这些差异表达cDNA序列可能与肺癌的发生发展密切相关。

cDNA-SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究

应用cDNA-SCOT研究了低温胁迫下不同抗寒性甘蔗品种的基因差异表达,比较了两种PCR产物电泳方法。结果表明,采用琼脂糖凝胶电泳成本较低,操作简单,省时,其凝胶图像条带亮白,背景为黑色,主带明显,副带较模糊;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳成本较高,操作复杂,耗时,其凝胶电泳图像条带呈黑褐色,背景为浅黄色,主带和弱带清晰易读,但部分引物泳道背景深,影响差异基因鉴别效果。根据两种电泳方法的优缺点,提出应用cDNA-SCOT进行基因差异表达研究时的相关建议。

用高密度cDNA微阵列技术检测鼻咽癌差异表达基因

背景与目的:鼻咽癌的发生与发展涉及多个步骤、多个因素的参与,对此目前尚缺乏了解。本研究试图通过大规模检测鼻咽癌的基因差异表达来揭示鼻咽癌的差异表达基因谱,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因。方法:用由18000个基因构建的高密度cDNA微阵列对21例鼻咽癌分3个样本池分别检测并与鼻咽非癌组织作对比分析,随机选2个基因用半定量RT-PCR验证检测结果。结果:3个样本池鼻咽癌差异表达基因分别为186个、95个和36个,总数达317个,表达上调的277个,表达下调的40个;差异表达基因中2个样本池以上有共同差异表达的基因有23个,表达上调的16个,表达下调的7个;其中3个样本池表达均有差异者6个,5个上调、1个下调,5个上调的基因中2个是已知基因,3个是未知基因,1个下调的是未知基因。结论:本研究揭示了鼻咽癌的基因表达谱,为了解鼻咽癌发生、发展的分子机理提供了大量信息,为寻找鼻咽癌相关基因提供了重要线索。

SRAP-cDNA方法在植物基因差异表达分析中的应用

对SRAP技术的原理方法、优点进行了介绍,并阐述了SRAP-cDNA方法的实验条件优化、应用现状及前景,表明SRAP-cDNA方法具有简便、重复性好、实验成本低等优点,可以在研究植物基因差异表达领域广泛应用,并成为作物育种、杂种优势分析等工作的重要工具。

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrombotic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选.方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取poly A+ mRNA,分别以poly A+ mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400～600 bp大小的片段.以PTS大鼠cDNA作为Tester,对照大鼠cDNA为Driver,进行抑制性消减杂交.将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pMD18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库.用巢式PCR扩增法制备'正向'和'反向'消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与GenBank DNA 数据库中的DNA序列进行同源性分析.结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段.结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库.

施氏鲟精巢和卵巢差减cDNA文库的构建和差异表达EST的筛选

应用抑制差减杂交(SSH)技术构建了施氏鲟(Acipenser schrenckii)精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cD-NA差减文库,从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测,随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,68个片段与已报道的基因有较高的同源性,其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因,而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子(EF-1)和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因,而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细胞发育成熟相关的基因。这些EST数据为进一步筛选和克隆鲟鱼性腺组织特异性表达基因提供了材料平台,为鲟鱼基因组数据增补了大量信息。[中国水产科学,2006,13(1):8-12]

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的构建

目的 构建高凝状态 (prothrombotic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向消减 c DNA文库。方法 用高淀粉饲料喂养制备大鼠 PTS模型 ,从 PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取 poly A+ m RNA ,分别以 1.5μgpoly A+ m RNA起始 ,依次合成单链和双链 c DNA,经酶切成平均大小为 4 0 0～ 6 0 0 bp的片段。以 PTS大鼠 c DNA作为 Driver,对照大鼠 c DNA为 Tester。将 Tester分为两组 ,分别连上不同的接头 ,与 Driver进行两次消减杂交和两次抑制性 PCR。将第二次 PCR产物 c DNA克隆至 p MD18- T载体上 ,然后转化细菌。转化后的细菌接种于含 5 0μg/ ml am picillin、IPTG、和 X- gal的 L B琼脂平板上 ,将克隆计数。结果 获得的克隆 78%为白色克隆 ,成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减 c DNA文库。结论 以 1.5μg poly A+ m RNA起始 ,采用抑制性消减杂交 ,构建了 PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减 c

鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β(IL-1β)全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析。[方法]利用DD-RTPCR方法获得差异表达cDNA片段,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行筛选,克隆了鲤鱼IL-1β的全长cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析。[结果]获得的阳性克隆含有1个大小为831 bp编码276个氨基酸的完整开放阅读框。聚类分析表明,鲤鱼IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠。差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期(4 h)白细胞中IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移(12,24 h)并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形。[结论]为进一步研究IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础。

胃癌相关cDNA片段的快速克隆和表达分析

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌和正常组织有差异表达的表达序列标签 (EST) W 12 3(GenBank登录号为AF15 0 6 31) ,通过与GenBank的dbest库进行电子杂交 ,选取了与其同源度高的若干EST ,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物 ,利用cDNA末端快速扩增PCR (RACE)技术得到了7条带有 polyA尾的 3′EST ,进行序列分析后 ,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST ,且具有共同的保守序列 ,已登录GenBank .采用RNA印迹对目的序列进行初步鉴定 ,并进行了这些基因的组织分布分析 .RACE技术和生物信息学相结合 ,具有快速、高效的特点 ,有助于疾病相关基因的克隆 .