差示扫描荧光及其在蛋白质研究中的应用

差示扫描荧光(differential scanning fluorimetry,DSF)是在荧光定量PCR仪上缓慢加热样品,在加热的过程中检测荧光染料与结构发生改变的蛋白质相结合的量,来评价蛋白质热稳定性的方法。该方法具有数据准确、高通量、蛋白质样品损耗较小和温度变化范围广的优点,目前已被广泛应用于蛋白质稳定性、结构和蛋白质-配体相互作用研究等领域。本文主要介绍了DSF的技术原理、仪器设备与反应体系、数据分析及应用进展,并对其发展趋势和前景进行评价,旨在为相关领域的研究提供一定的参考。

差示扫描荧光法快速筛选高浓度人免疫球蛋白液体制剂处方

目的建立高浓度人免疫球蛋白液体制剂处方的差示扫描荧光(differential scanning fluorimetry,DSF)快速筛选法。方法采用DSF法和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)法分别测定高浓度人免疫球蛋白制剂的转变中点温度(T_(mid))和变性温度(T_m),比较两种方法的一致性;同时检测人免疫球蛋白制品中聚集体形成量与T_(mid)值的关系;以T_(mid)为指标评价溶液环境对人免疫球蛋白制剂稳定性的影响;ELISA法检测人免疫球蛋白制剂中抗乙肝免疫球蛋白(抗-HBs)活性的影响。结果不同制剂处方中DSF法测定的人免疫球蛋白的T_(mid)值与DSC法测定的T_m值呈线性关系,R^2=0.963;T_(mid)值与制剂中聚集体形成量呈良好的线性关系,R^2=0.933;制剂中蛋白浓度升高,其热稳定性降低,糖和糖醇及氨基酸类稳定剂的稳定效果优于氯化钠及精氨酸和谷氨酸的混合物;甘氨酸和脯氨酸对制剂中抗-HBs活性的保护效果与某些糖类和糖醇类相当。结论 DSF具有蛋白检测浓度范围广、样品用量少和检测速度快等优点,可用于高浓度人免疫球蛋白液体制剂处方的快速筛选。

三种测定蛋白质热稳定性方法的比较

蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(melting temperature,T_(m))来表示,即蛋白质解折叠50%时的温度.测定蛋白质T_(m)值的常用方法有差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)、圆二色光谱法(circular dichroism,CD)和差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry,DSF)等.为了比较不同方法的检测特点和效果,选择了5种具有不同结构特点的蛋白,分别使用上述方法对其T_(m)值进行测定.结果发现,三种方法测得的T_(m)值整体上较为一致,但也存在一定的差异.研究还发现,结构更复杂的蛋白,并不一定具有更多T_(m)值.

高通量筛选技术应用于抗体药物处方开发的研究

通过实验设计和高通量筛选(HTS)设备进行蛋白药物制剂处方开发筛选,分析和评估,确定HTS制剂处方筛选方法是否具备在大多数情况下,快速和较为准确判定蛋白药比如抗体药物的最佳临床处方的能力。利用HTS设备进行预筛选,初步遴选进入缓冲体系筛选的5个基础缓冲液,在进行25℃和40℃加速强制条件研究后,最终确立进入辅料筛选的最佳缓冲液;利用最佳缓冲液组合不同辅料(8.0%蔗糖,8.0%海藻糖,5.0%甘露醇,2.0%甘氨酸,2.4%赖氨酸)和0.02%吐温80设计实验,每个处方配制80μL样品溶液,利用HTS设备进行快速初筛,最终确定含有蔗糖,海藻糖,甘露醇,甘氨酸的处方进入正式的辅料筛选环节;实验通过300 r/min振荡,5℃/25℃/40℃条件研究,利用HTS筛选和SEC(Size exclusion chromatography体积排阻色谱)/CEX(Cation exchange chromatography阳离子交换色谱)/CE(Capillary electrophoresis毛细管电泳)/UV410(紫外可见分光计410 nm波长)等分析方法确定最终处方。经过高通量筛选检测和其他测试结果,最佳处方可以在5℃保持碎片和聚集体含量基本恒定;25℃条件下孵育30 d加速实验研究时碎片和聚集体含量基本恒定,并且SEC主峰含量在95%以上;40℃强制条件下孵育2 w也能保持聚集体含量基本恒定;上述分析结果已经显示出高通量筛选技术符合处方筛选关于抗体药物稳定性的技术要求。综合来看,高通量筛选技术通过测试Tm/Tagg/DLS等参数可以满足蛋白药开发需求,经过与传统分析手段的交叉验证,HTS和传统分析两种方式的分析结果存在一定的相关性,再全面进行考察可以确定最佳处方,可以确定利用高通量筛选技术能筛选出满足临床使用要求的蛋白药物制剂。

多元醇对全人源抗VEGF_(165)单克隆抗体构象稳定性及胶体稳定性的影响

通过研究4种多元醇(海藻糖、甘露醇、山梨糖和蔗糖)对全人源抗VEGF165单克隆抗体(HVAB)构象及胶体稳定性的影响,筛选出最优的HVAB稳定剂并探讨多元醇稳定抗体的作用机制。该研究运用差示荧光扫描法(Differential scanning fluorimetry,DSF)判断多元醇对抗体热稳定性的影响;采用圆二色光谱(Circular dichroism,CD)和二阶导数色氨酸荧光光谱探讨多元醇对抗体构象稳定性的影响;聚乙二醇诱导抗体发生液-液相分离现象判断多元醇对抗体胶体稳定性的影响。结果表明4种多元醇均能提高抗体的热稳定性及胶体稳定性;多元醇作为辅料添加到溶液中会引起抗体构象发生变化,圆二色谱结果显示HVAB二级结构发生变化,但仍然以β-折叠为主;海藻糖和甘露醇引起HVAB发生去折叠,并未引起抗体发生聚集或片段化,同时提高了抗体的胶体稳定性;山梨糖提高抗体Tm值效果最明显,在稳定抗体胶体结构方面也表现突出,且作为添加剂对抗体二级结构影响最小。说明抗体的构象稳定性和胶体稳定性相互影响;山梨糖可作为HVAB的最优稳定剂。