胰蛋白酶差速脱壁法分离纯化人表皮干细胞

背景:表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义,但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。目的:拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在解放军军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室完成。材料:实验所用皮肤来源于20～30岁女性乳房缩小整形术患者,由北京协和医院整形外科提供。方法:无菌条件下切取皮肤,剪除皮下脂肪组织,采用胶原酶/Dispase酶和胰蛋白酶两步法体外分离培养表皮干细胞。待细胞生长达70%～80%融合时,加入胰蛋白酶消化尚未脱壁的细胞,30s～1min后吸出脱壁细胞,同法传代培养至第5代细胞。主要观察指标:第1,5代表皮干细胞表面标志CD29、CD49f、CD71的表达。流式细胞仪检测第5代细胞生长周期。免疫荧光检测第5代表皮干细胞和传代时胰蛋白酶消化30s～1min即脱壁细胞角蛋白19及波形蛋白的表达。透射电镜观察表皮干细胞超微结构。结果:第1代表皮干细胞CD29阳性率94.32%,CD49f阳性率86.24%,CD71呈弱阳性,经过4次胰蛋白酶差速脱壁去除混杂细胞后,第5代表皮干细胞CD29阳性率96.77%,CD49f阳性率96.31,CD71呈弱阳性,82.58%表皮干细胞处于G0～G1期。第5代表皮干细胞角蛋白19呈阳性,波形蛋白呈阴性,而传代时胰蛋白酶消化脱壁的细胞角蛋白19呈阴性,波形蛋白呈阳性,证实为成纤维细胞。表皮干细胞呈克隆样生长,透射电镜下胞质中可见呈束状排列的角蛋白丝。结论:应用胰蛋白酶差速脱壁法能够简单、有效地获取纯化的表皮干细胞。

酶差速脱壁法联合差速贴壁法分离人颊黏膜上皮干细胞

目的培养人颊黏膜上皮细胞和分离上皮干细胞,在角膜缘干细胞微环境下诱导颊黏膜上皮干细胞转分化,为前者获取足够的种子细胞。方法应用Epilife培养基培养颊黏膜上皮细胞,使用CFSE标记,观察CFSE标记率及标记细胞与未标记细胞的生物学特性。采用免疫荧光检测第2代细胞P63、CK12、CK13的表达。应用酶差速脱壁法联合差速贴壁法分离培养颊黏膜上皮干细胞,观察体外培养生物学特性。采用免疫荧光检测第2氉代纯化细胞P63、CK12、CK13的表达。结果颊黏膜上皮细胞在Epilife培养基中生长良好。CFSE标记率可达100%,标记细胞与未标记细胞生物学特性相似。经联合分离法获得的第2代细胞免疫荧光P63、K13阳性,K12阴性,而未经联合分离法获得的第2代细胞免疫荧光CK13阳性,P63、CK12阴性。结论人颊黏膜上皮细胞在Epilife培养基中生长良好。CFSE是理想的颊黏膜上皮细胞荧光标记物。酶差速脱壁法联合差速贴壁法纯化了颊黏膜上皮干细胞,为转分化为角膜上皮干细胞获取了足够的种子细胞。