差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究

本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术(FCM)检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似"S"形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为(93.32±1.65)%、EPC G0-G1为(93.05±1.95)%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为(99.7±1.12)%、(99.1±2.33)%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为(4.8±0.38)%、(6.8±0.49)%及(0.4±0.08)%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(82.1±3.4)%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%,鉴定为EPC。结论:应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。

差速贴壁技术对大鼠脑皮质星形胶质细胞纯化率的影响

目的:观察差速贴壁技术对星形胶质细胞纯化率的影响,旨在建立一套可靠的大鼠脑皮质星形胶质细胞的取材分离、纯化培养技术。方法:实验于2006-06/08在泰山医学院生命科学研究所完成。实验材料:出生2～3d的Wistar大鼠,雌雄不拘,由泰山医学院生命科学研究所实验动物中心提供。实验方法:选用出生二三天的Wistar大鼠进行脑皮质星形胶质细胞原代培养。实验分两组培养:常规培养组和差速贴壁培养组。差速贴壁培养组分别于15,30min取出,轻轻翻转培养瓶,将上清液移至另一培养瓶中,放入培养箱中继续培养。7～10d后传代,待细胞分层生长后,置于37℃摇床中250r/min振荡18h,倒掉上清液,D-Hank’s液洗3次后,加入0.25%胰酶消化,倒置显微镜下观察,待细胞突起回缩后加入含血清的培养基终止消化,用吸管反复吹打使细胞从瓶壁上脱落,细胞悬液1000r/min离心5min后,弃上清液,加入含体积分数为0.2血清的DMEM培养基混悬沉淀,接种入预先涂有L-多聚赖氨酸的培养瓶中继续培养。采用双重免疫荧光法鉴定星形胶质细胞纯度,测定积分吸光度值判断星形胶质细胞的生长状况。结果:①应用差速贴壁技术培养星形胶质细胞可明显提高星形胶质细胞纯度[常规培养组:(82±3)%,差速贴壁培养组15min:(94±2)%,差速贴壁培养组30min:(95±2)%,P<0.01]。差速贴壁需要充分的时间,15min组和30min组在提高星形胶质细胞纯度方面无明显差别。②差速贴壁培养组星形胶质细胞积分吸光度值高于常规培养组(常规培养组:528±25,差速贴壁培养组15min:972±17,差速贴壁培养组30min:996±35,P<0.05)。结论:①差速贴壁技术可明显提高星形胶质细胞纯化度,并且星形胶质细胞生长状态明显优于常规培养方法。②最佳差速贴壁时间为15min,过长差速贴壁时间对提高星形胶质细胞纯度无明显影响。

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。

以差速贴壁与化学药物并胰酶限时消化法纯化新生大鼠嗅鞘细胞:优于单一差速贴壁和化学药物法吗?

背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用。目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成。材料:新生2d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供。方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5mm3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×108L-1密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养。设立4组:①未经纯化的常规对照组。②化学药物组加入5μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂。③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25g/L胰蛋白酶消化1min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化。主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFRp75免疫细胞荧光染色结果。结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同。存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%;差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上。结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法。

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景:髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化。目的:体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞。方法:经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织,第1,2代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞。结果与结论:分离纯化后的第3代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8生长曲线显示细胞经过2d的生长潜伏期,3d的指数生长期,进入生长停滞期。说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞

背景:研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞,并应用于各类组织工程和再生医学研究。目的:结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞,并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。方法:以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象,经三重酶消化和细胞筛过滤,运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色;以有限稀释技术克隆培养的方法,获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。结果与结论:差速贴壁培养过程中,肌性细胞占比逐渐增高,首次贴壁1h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养;肌源干细胞需72h左右贴壁生长,经10d左右可以增殖为300～500细胞数量的集落,细胞形态以小圆形细胞为主,并有少量梭形细胞,肌源干细胞能够维持形态并持续增殖;应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落,肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性,Sca-1染色阳性,阳性率为(92.3±4.1)%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。

差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响

目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞，分别进行1—3次差速贴壁并联用或不联用5-BrdU以纯化心肌细胞。正常培养3d后，观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加，心肌细胞得以纯化，但细胞的活性有所下降。联用5-BrdU后细胞纯度进一步提高，且对细胞的活性无明显影响；其中两次差速贴壁并联合应用5-BrdU后，可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-BrdU为纯化心肌细胞的有效方法。

差速贴壁法分离培养脂肪源间充质干细胞

目的:探讨差速贴壁法从大鼠腹股沟脂肪垫分离纯化脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)的可行性。方法:采用差速贴壁培养法分离ADMSCs,并与普通培养法得到的ADMSCs进行表面分子CD44阳性率对比。在第2代ADMSCs中加入条件培养基进行诱导,根据条件培养基的不同分成3组:①成骨诱导组:加入成骨培养基;②成脂诱导组:加入成脂培养基;③对照组:仅加入基础培养基。成骨诱导组和对照组进行碱性磷酸酶(ALP)检测,成脂诱导组和对照组进行油红O染色检测。结果:差速贴壁培养法获得CD44阳性率更高的ADMSCs。成骨诱导组的ALP大大高于对照组,成脂诱导组油红O染色阳性,对照组油红O染色均为阴性。结论:差速贴壁培养法从大鼠腹股沟脂肪垫中分离得到高纯度ADMSCs。

改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞

背景：目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低。目的：拟采用改良Nash差速贴壁＋阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成。材料：10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备。方法：完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×10^9L^-1密度接种于未包被的25cm^2玻璃培养瓶中,18-20h后将细胞悬液转移至另一未包被的25cm^2玻璃培养瓶中（第1次差速贴壁）,24h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25cm^2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中（第2次差速贴壁）,接种培养48h后半量换液以去除杂细胞。在差速贴壁培养后二三天,加入3.0-5.0pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞。主要观察指标：嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定。结果：体外培养24h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞。纯化培养10d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75＋hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上。结论：改良Nash差速贴壁＋阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞。

不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究

目的:探讨心肌细胞分离、纯化和培养方法。方法:采用不同差速贴壁时间分离、纯化、培养新生乳鼠心肌细胞。结果:心肌细胞培养,采用差速贴壁60min组与90min组之间无统计学意义,差速贴壁60min组、90min组与差速贴壁120min组两两之间均有统计学差别。结论:心肌细胞培养过程中,采用差速贴壁60min、90min较差速贴壁120min获得的心肌细胞数量高。

采用差速贴壁法培养动物及人细胞研究进展

细胞培养是现代生物医学的重要技术之一,在细胞生物学、生物化学、临床检验学等领域应用较为广泛,成为阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段,已成为医药生物技术产业的重要部分之一[1]。差速贴壁法由Kreider和Pleasure等较早报道。该方法更加便于研究者简便探索细胞特别是胚胎干细胞诱导分化的机制，并有利于对结果进行精确、快速的检测。因此通过单层贴壁诱导途径进行细胞的培养、分化的研究报道越来越多。本文对近年来采用差速贴壁法培养动物及人细胞的文献进行综述如下。

差速贴壁法在原代星形胶质细胞纯化中的应用

为获得高纯度的星形胶质细胞,在大鼠新生P0乳鼠大脑皮层的原代培养后,采用差速贴壁法予以纯化.经细胞免疫荧光染色鉴定,差速贴壁30min及1h处理获得的星形胶质细胞纯度高、状态好,能满足神经生物学研究中对高纯度星形胶质细胞培养的实验要求,适宜推广.

利用差速贴壁法分离成年小鼠卵巢中雌性生殖干细胞

雌性生殖干细胞(female germline stem cells,FGSCs)的出现挑战了传统观点。雌性生殖干细胞又称为卵巢生殖干细胞(oogonial stem cells, OSCs),由原始生殖细胞(primary germ cells, PGCs)转化而来,具有能够定向分化为卵母细胞的能力,可望补充不断消耗的始基卵泡池,是生殖生物学的革命性发现。然而目前只有少数研究团队能够成功分离FGSCs并最终建立稳定的细胞系,究其原因主要是实验程序的复杂性以及卵巢中该细胞数量极其罕见,所以急需寻求一个简单可靠的方法来分离FGSCs。在本研究利用差速贴壁法从成年小鼠卵巢中分离FGSCs。通过2次差速贴壁纯化和5-7次传代培养,获得了稳定的FGSCs细胞系,通过RT-PCR,免疫荧光,碱性磷酸酶染色以及核型分析等多方面鉴定该细胞的特性。在此项研究中,研究者尝试利用差速贴壁法来获得FGSCs,并证实了该细胞是来源于生殖系的干细胞。根据实验经验和其他研究,发现体细胞沉降速率的速度比FGSCs更快,所以利用差速贴壁法初步纯化FGSCs。总之,差速贴壁法是一种相对于磁珠分选和流式分选更为可行和简单的操作方法,此方法将大大提高分选效率从而将有利于推进干细胞基础研究和临床应用。

分离MEF和ES细胞的差速贴壁法研究(简报)

胚胎干细胞的分化控制是胚胎干细胞研究的一个重要方面。由于常规的拟胚体诱导途径是在形成拟胚体后才开始进行诱导分化．受多种胚层的共同作用使得我们无法简便探索诱导分化的机制，而且用这种方法进行的诱导分化试验的结果检测比较困难且不够精确，因此通过单层贴壁诱导途径进行胚胎干细胞的分化研究的报道越来越多。Ying QL and Takahashi T．等使用了一种不经过拟胚体途径的单层ES细胞培养方法，不仅简化了操作步骤，而且能够精确观察到诱导分化的过程。

差速贴壁法体外培养人脐血内皮祖细胞的实验研究

目的建立一种经济可靠、稳定、高纯度内皮祖细胞的培养方法。方法采用 Ficoll 密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,于包被人纤连蛋白的培养皿中贴壁培养,收集48 h后的悬浮细胞重新贴壁培养至第7天,利用免疫组化、免疫荧光及流式细胞术对培养的细胞进行鉴定。结果培养的细胞呈短梭形、多角型、胞体小;可见到大量典型的内皮祖细胞克隆;vWF 和 flk-1免疫组化细胞阳性率>95%,免疫荧光 Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-1双染阳性的细胞阳性率>98%,流式分析 CD_(133)^+细胞的百分率为(7.0±1.8)%。结论差速贴壁法是一种经济可靠、稳定、高纯度内皮祖细胞的培养方法。

单次差速贴壁法纯化培养大鼠嗅神经鞘细胞的实验研究

目的:探讨单次差速贴壁法纯化培养成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的可行性。方法:选取8～10周龄的成年SD大鼠,无菌条件下切取嗅球、剪碎,胰酶消化制成细胞悬液后接种,采用18h单次差速贴壁的方法纯化培养嗅鞘细胞,定期在倒置显微镜下观察嗅鞘细胞的形态学变化及生长情况,并对其行神经生长因子受体p75抗体(NGFRp75)及碘化丙啶的免疫荧光鉴定,同时计算嗅鞘细胞的纯度。结果:通过18h单次差速贴壁法纯化培养的嗅鞘细胞经NGFRp75免疫荧光鉴定后,纯度可达70%～80%,形态上以双极和三极细胞为主,伴有少许单极及多极细胞。结论:应用18h单次差速贴壁法纯化培养嗅鞘细胞是一种简便、稳定、经济、快捷的方法。

差速贴壁法原代培养椎间盘髓核细胞中的应用优势

背景:髓核细胞作为椎间盘的主要功能细胞是退变机制研究的重点对象,维持体外培养的髓核细胞的生理功能及细胞表型的稳定至关重要。目的:通过对照研究差速贴壁法在犬鼠椎间盘髓核细胞原代培养中的应用优势。方法:取4周龄雄性Wistar大鼠20只,体外分离培养椎间盘髓核细胞,待原代细胞汇合近90%时进行分组传代,差速贴壁组在传代细胞贴壁30 min时,将未贴壁细胞吸出重新调整浓度后传至新的培养皿中,对照组不作处理。差速贴壁组第1、2代细胞均采用该法分离纯化。对两组第3代细胞进行细胞形态学比较及免疫组化鉴定纯度分析、CCK-8检测细胞功能活性并绘制细胞生长曲线。结果与结论:(1)倒置显微镜观察及苏木精-伊红染色,差速贴壁组细胞均一性较对照组明显增高,对照组髓核细胞中混有较多的成纤维样细胞;(2)Ⅱ型胶原免疫组化鉴定及纯度分析,2组细胞胞浆均为被染成黄褐色,证实为髓核类软骨细胞;(3)纯度分析差速贴壁组阳性率显著高于对照组(P<0.05);(4)CCK-8细胞生长曲线显示,2组细胞均经过2d的生长潜伏期,3d的指数生长期,进入生长停滞期,而对照组较差速贴壁组在潜伏期和指数增长期的早期生长更迅速。(5)结果说明,差速贴壁法是原代培养大鼠髓核细胞一种实用、有效的分离纯化方法;原代培养、经2次差速贴壁法分离纯化的第3代大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致,细胞纯度更高,其对数增长期可以作为椎间盘细胞机制研究的最佳时期。

酶差速脱壁法联合差速贴壁法分离人颊黏膜上皮干细胞

目的培养人颊黏膜上皮细胞和分离上皮干细胞,在角膜缘干细胞微环境下诱导颊黏膜上皮干细胞转分化,为前者获取足够的种子细胞。方法应用Epilife培养基培养颊黏膜上皮细胞,使用CFSE标记,观察CFSE标记率及标记细胞与未标记细胞的生物学特性。采用免疫荧光检测第2代细胞P63、CK12、CK13的表达。应用酶差速脱壁法联合差速贴壁法分离培养颊黏膜上皮干细胞,观察体外培养生物学特性。采用免疫荧光检测第2氉代纯化细胞P63、CK12、CK13的表达。结果颊黏膜上皮细胞在Epilife培养基中生长良好。CFSE标记率可达100%,标记细胞与未标记细胞生物学特性相似。经联合分离法获得的第2代细胞免疫荧光P63、K13阳性,K12阴性,而未经联合分离法获得的第2代细胞免疫荧光CK13阳性,P63、CK12阴性。结论人颊黏膜上皮细胞在Epilife培养基中生长良好。CFSE是理想的颊黏膜上皮细胞荧光标记物。酶差速脱壁法联合差速贴壁法纯化了颊黏膜上皮干细胞,为转分化为角膜上皮干细胞获取了足够的种子细胞。

差速贴壁法分离人子宫腺肌病病灶细胞的平滑肌细胞的纯化时间探讨

目的探讨差速贴壁法获取人子宫腺肌病病灶细胞的平滑肌细胞的纯化时间。方法采取组织块酶消化法进行子宫腺肌病病灶细胞原代培养,待生长融合80%~90%时根据细胞贴壁时间分为未处理组及15 min、 30 min、 60 min、 90 min四个时间组,各时间贴壁组与未贴壁组进行细胞筛选与培养,以免疫组化方法鉴定平滑肌细胞及其纯度。结果 400倍镜视野下每组16个视野计数算滑肌细胞数百分比,未处理组最低,为12.60%;未贴壁15 min组最高,为73.38%,与未处理组比较有统计学差异(P <0.01);贴壁90 min组与未处理组比较无统计学差异(P>0.05)。结论用差速贴壁法分离人子宫腺肌病病灶的平滑肌细胞可通过贴壁15 min剔除大部分杂质细胞,选择15 min内未贴壁细胞继续培养传代可进一步获取纯度更高的子宫平滑肌细胞。

差速贴壁分离法:获得小鼠骨髓内皮祖细胞诱导分化培养的最佳贴壁时间

本文旨在比较差速贴壁方法分离的不同时间点贴壁的小鼠骨髓单个核细胞诱导分化为内皮祖细胞的生物学特性,探讨最适宜贴壁时间。Ficoll密度梯度离心分离小鼠骨髓单个核细胞,接种于预先铺有纤维连接蛋白的培养板上,定义为1d贴壁细胞组,取1d非贴壁细胞再接种为3d贴壁细胞组,继续培养2d取非贴壁细胞再接种为3d非贴壁细胞组,继续培养20d后,分别检测3组诱导分化内皮祖细胞亚群表面标志、粘附能力和成血管能力。结果显示,1d贴壁细胞中CD34+、FLK-1+、CD34+/FLK-1+细胞数明显多于3d贴壁细胞和3d非贴壁细胞(P<0.01);1d贴壁细胞粘附能力、成血管能力均显著高于3d贴壁细胞和3d非贴壁细胞;1d贴壁细胞和3d贴壁细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial NO synthase,eNOS)表达量无显著差异,但均显著高于3d非贴壁细胞(P<0.01);3d贴壁细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达水平显著高于1d贴壁细胞和3d非贴壁细胞(P<0.01)。以上结果提示,小鼠骨髓单个核细胞1d贴壁诱导分化的内皮祖细胞生物学功能显著高于3d贴壁细胞和3d非贴壁细胞;3d贴壁细胞较1d贴壁细胞和3d非贴壁细胞表达较多的VEGF,1d贴壁细胞和3d贴壁细胞eNOS表达高于3d非贴壁细胞。小鼠骨髓内皮祖细胞诱导分化培养最适宜贴壁时间为1～3d。