3-巯基丙酮酸硫转移酶产生的硫化氢在大鼠脑血管张力和脑血管内皮细胞缺氧损伤中的作用

目的 研究3 巯基丙酮酸硫转移酶(3 mercaptopyruvate sulfurtransferase,3 MST)产生的硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)在 大鼠脑血管张力和血管内皮细胞缺氧损伤中的作用。方法 将大鼠脑基底动脉血管按随机数字表法分为Krebs Henseleit缓 冲液对照组、3MP组、ASP组、SIN 1组、ASP+SIN 1组、3MP+SIN 1组。通过微血管张力仪来测量大鼠脑基底动脉血管的张 力,收集张力仪浴槽中的灌注液并测定灌注液中硫化氢含量。原代培养大鼠脑血管内皮细胞,将细胞按随机数字表法分为对 照组、模型组、3MP组、ASP组、SIN 1组、3MP+SIN 1组。除对照组外,其他5组建造急性缺氧4 h模型,用药组分别给予相应的 药物预处理。然后测定缺氧损伤后内皮细胞活力,上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含 量,以及活性氧的含量。结果 3 MST底物 硫基丙酮酸二水合物(3 mercaptopyruvate,3MP)和 3 MST激动剂5 氨基 3 ( 4 吗啉基) 1, 2, 3 恶二唑鎓盐酸盐(3 morpholino sydnonimine hydrochloride,SIN 1)能 够舒张血栓素A2受体激动剂U46619预收缩的大鼠脑基底动脉,最大收缩率为(94.67± 3.99) %;与单独使用SIN 1相比,3 MST抑制剂天门冬氨酸(L aspartic acid,ASP)能 够减弱SIN 1舒张血管的作用,而3MP能增 强SIN 1的血管舒张作用。同时,3MP和SIN 1可以增加血管灌注液中的硫化氢的含量(90.09±5.36) μmol,而ASP可以减少 SIN 1增加的硫化氢。与急性缺氧组相比,3 MST抑制剂ASP能够进一步降低细胞活力,升高LDH活性;而3 MST激动剂SIN 1 和底物3MP能够改善细胞损伤,提高细胞活力,降低LDH活性(112.63±8.08) U/L,降低活性氧。结论 3 MST产生的硫化氢可 介导脑血管舒张,保护脑血管内皮细胞。

3-MST mRNA在大鼠延髓的表达以及急性缺氧对其基因表达的影响

目的探讨3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)mRNA在正常、急性缺氧及急性缺氧加外源性H2S条件下的表达情况。方法 21只SD大鼠随机等分为正常对照组、急性缺氧组和急性缺氧+NaHS(H2S供体)组。建立大鼠急性缺氧模型,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,观察各组大鼠延髓3-MST mRNA的表达水平。结果正常大鼠延髓有3-MST mRNA表达;给予急性缺氧刺激后,大鼠延髓3-MST mRNA表达量明显增加(P<0.05);急性缺氧+NaHS组3-MST mRNA表达量比急性缺氧组明显减少(P<0.05)。结论 3-MST mRNA存在于正常成年大鼠延髓组织中,急性缺氧可上调其表达,外源性H2S可抑制由缺氧所引起的3-MST mRNA表达的增加,提示3-MST-H2S途径可能参与急性缺氧大鼠延髓呼吸中枢缺氧损伤保护作用及节律性呼吸的中枢性调节。

亚砷酸钠对SH-SY5Y细胞周期的影响及MPST过表达的干预

目的探讨亚砷酸钠(NaAsO_2)对神经细胞周期的影响及MPST过表达在其中的作用。方法以空白组(正常SH-SY5Y细胞,BC)、空载对照组(NC)、过表达组(过表达MPST,OP)细胞分别经NaAsO_2处理后,采用CCK-8法、结晶紫染色法、流式细胞术和Western blot法,分别检测细胞活力、细胞贴壁力、细胞周期及p53、CDC25A、CyclinA、CDK2等蛋白表达水平。结果经NaAsO_2处理48 h后,NC组细胞存活率、细胞贴壁率明显降低,而过表达MPST细胞上述变化明显得到改善(P<0.01)。同时,NaAsO_2明显上调BC、NC组细胞S期比例和p53蛋白表达,而下调CDC25A、CyclinA及CDK2蛋白(P<0.01);然而,过表达MPST则明显拮抗上述效应(P<0.05,P<0.01)。结论 NaAsO_2通过诱导SH-SY5Y细胞S期阻滞,抑制细胞生长,而过表达MPST可拮抗NaAsO_2诱导的毒性效应。

MST过表达及亚砷酸钠对SH-SY5Y细胞的影响

目的:探讨亚砷酸钠(NaAsO 2)、巯基丙酮酸硫转移酶(MST)基因过表达对SH-SY5Y细胞的作用及机制。方法:将空载体转染细胞、MST过表达细胞各分为对照组、NaAsO 2组、TUDCA(内质网应激阻断剂)组、NaAsO 2联合TUDCA组,采用MTT、Western blot和酶活性检测等方法观察细胞活力、Bax、Bcl-2凋亡相关蛋白表达及Caspase-3活性。结果:50μmoL/L NaAsO 2暴露24 h显著降低空转组细胞活力和Bcl-2蛋白水平(P<0.01),增加Bax蛋白表达及Caspase-3活性(P<0.01);TUDCA预处理可以逆转以上变化,Bcl-2的蛋白表达则在MST基因过表达细胞砷暴露后发生显著增加,但可被TUDCA所拮抗(P<0.01)。结论:内质网应激可能参与砷、内源性H 2S对SH-SY5Y细胞损伤的影响。

砷及MPST过表达对SH-SY5Y细胞GRP78/CHOP通路的影响

目的探讨内质网应激是否参与亚砷酸钠(NaAsO2)神经毒性损伤,明确3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MPST)过表达是否调节砷诱导的内质网应激。方法通过构建MPST基因慢病毒表达载体来获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株作为SH-MPST过表达组,另设空载体转染细胞为SH-PEB组,染砷组(NaAsO2组),内质网应激阻断剂TUDCA组,TUDCA预处理染砷组。Western blot法分别检测过表达MPST、染砷及TUDCA预处理后细胞内GRP78和CHOP蛋白表达的变化。结果单纯MPST过表达不影响SH-SY5Y细胞内GRP78、CHOP蛋白的表达水平;经NaAsO2处理后,SH-PEB细胞内GRP78、CHOP蛋白明显上调(P<0.01),而被内质网应激阻断剂TUDCA所拮抗;MPST过表达则抑制砷对GRP78、CHOP蛋白的上调(P<0.01);然而,TUDCA预处理则明显逆转MPST过表达对GRP78、CHOP蛋白的影响(P<0.01)。结论GRP78/CHOP内质网应激通路参与了砷诱导的神经毒性损伤;MPST过表达可降低砷诱导的内质网应激水平。

嗜酸热古菌Metallosphaera cuprina中MST的初步分析与鉴定

3-巯基丙酮酸硫转移酶(MSTs)为细胞内重要的参与脱毒与抗氧化的硫转移酶,在生物体内广泛分布。Metallosphaera cuprina为嗜酸嗜热硫代谢古菌,前期研究发现其基因组中具有MSTs同源蛋白的编码基因,本研究对该基因的序列进行了分析,对其所编码的蛋白结构进行了同源建模,并进行了基因克隆和蛋白表达,以期对该蛋白的基本特点进行初步鉴定。

外源性硫化氢诱导大鼠神经胶质瘤血管形成机制的研究

目的研究外源性硫化氢(H2S)对大鼠胶质瘤血管形成的诱导机制。方法成年SD大鼠40只,随机分为4组,对照组、硫氢化钠(Na HS)组、肿瘤组、肿瘤+Na HS组,每组10只。肿瘤组、肿瘤+Na HS组,大鼠纹状体内注射C6胶质瘤细胞,建立胶质瘤模型;对照组、Na HS组,大鼠大脑不做任何处理。4组大鼠正常饲养3周后,对其进行断头取脑,用敏感硫电极法检测各组大鼠脑组织及瘤内H2S的含量;Real time PCR法检测胱硫醚-β-合成酶(CBS)、3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)的mRNA转录水平;ELISA及蛋白免疫印迹法检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达;同时计数瘤内微血管密度(CD105-MVD)。结果肿瘤组、肿瘤+Na HS组,均可见明显的肿瘤组织,与对照组相比,瘤内毛细血管数明显增多;肿瘤+Na HS组,瘤体内有更多的HIF-α、VEGF、MMP-9的表达,且MVD明显高于对照组、Na HS组、肿瘤组(均P<0.01)。结论外源性H2S能诱导并促进大鼠恶性胶质瘤内的血管生成,其发生机制可能与H2S促进CBS、3-MST、HIF-α、VEGF及MMP-9的表达密切相关。