人肝再生增强因子FAD辅助的巯基氧化酶活性测定及其活性位点研究

目的:建立一种灵敏、简便、有效的判断人肝再生增强因子蛋白(ALRp)巯基氧化酶活性的方法,并分析ALRp的CXXC活性结构域在其发挥酶活性中的作用。方法:通过定点突变将ALRp的CXXC结构中的一个半胱氨酸突变为丙氨酸。巯基氧化酶实验分4组:①ALR组;②ALR-FAD组;③ALR突变体-FAD组;④无蛋白对照组。以还原型谷胱甘肽(GSH)为底物,于不同时点测定每组巯基浓度。结果:ALR-FAD组巯基浓度随时间的推移不断下降;其它3组巯基浓度在整个实验中均无明显变化。结论:建立了一种半定量分析ALRp巯基氧化酶活性的方法;并证明ALRp必须在FAD辅助下发挥酶活性,且ALRp的CXXC结构是ALRp具有该酶活性必不可少的部分。

伯氏疟原虫静息巯基氧化酶表达阶段的确定

目的观察伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(PbQSOX)的表达阶段及表达特点。方法分别采用SignalP-5.0 Server与TMHMM Server 2.0在线软件对PbQSOX蛋白的信号肽与跨膜区进行预测分析。利用同源重组技术,将PbQSOX-HA标签型打靶质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切使其线性化,将线性化的质粒电转染至伯氏疟原虫株内并感染小鼠。经乙胺嘧啶筛选耐药型疟原虫血症小鼠,取小鼠外周血进行PCR鉴定,获取PbQSOX-HA标签型疟原虫。培养纯化裂殖体、配子体与动合子阶段的PbQSOX-HA标签型疟原虫,采用蛋白质印迹法与间接免疫荧光实验检测PbQSOX蛋白在伯氏疟原虫中的表达阶段与表达特点。结果生物信息学分析发现PbQSOX蛋白存在信号肽,不存在跨膜区,蛋白均在细胞膜外表达。经PCR鉴定,PbQSOX-HA标签型打靶质粒与伯氏疟原虫同源重组正确,并成功获得了PbQSOX-HA标签型疟原虫及纯化的PbQSOX-HA标签型裂殖体、配子体与动合子。蛋白质印迹法检测显示PbQSOX蛋白主要在配子体与动合子阶段表达,间接免疫荧光实验结果显示PbQSOX表达于配子体、雄配子、合子、retort与动合子表面。结论PbQSOX是伯氏疟原虫在有性生殖阶段表达的蛋白,主要表达于配子体、雄配子、合子、retort与动合子表面。

酱油曲霉产巯基氧化酶发酵培养基的优化

以提高酱油曲霉ATCC20235产巯基氧化酶(SOX)产量为目的,选择碳源、氮源、发酵培养基初始pH及8种金属离子分别进行单因素实验,在此基础上选取8个主要因素进行正交实验。结果表明,以碳源(蔗糖)30g/L、氮源(鱼粉蛋白胨)6.8 g/L,K2HPO4·3H2O 15 g/L,MnCl2·4H2O 2 mg/L,BaCl2 500μg/L,H3BO3 1 mg/L,起始pH 8.5的优化培养基在30℃下,220 r/min培养72 h,获得发酵液巯基氧化酶产量达240U/L,优化后的酶产量比在专利文献中记载的发酵培养基及培养条件下的产酶量提高了10倍。

巯基氧化酶在国产面包粉中应用的初探

借助粉质仪、质构仪等仪器设备研究了巯基氧化酶对国产优质小麦粉品质的改良效果以及对面包品质改良进行系统比较研究。确定该巯基氧化酶能显著改善面团流变学特性和面包品质,是一种安全、高效、经济、实用的面包改良剂原料。

伯氏疟原虫静息巯基氧化酶的生物信息学分析和体外酶活检测

目的克隆、表达伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(PbQSOX)基因,纯化重组Pb QSOX蛋白(rPbQSOX),并对其生物信息学特点和酶活性进行分析。方法分别采用BLAST、SMART、ClustalW对P QSOX蛋白的信号肽、蛋白结构域、活性位点、同源性进行分析;通过BLAST和MAGA5构建PbQSOX的系统进化树;应用SWISS-MODEL对PbQSOX蛋白的三级结构进行预测。BALB/c雌性小鼠经腹腔感染伯氏疟原虫(1×10^7/鼠),于感染后第4天提取疟原虫基因组DNA。PCR扩增PbQSOX基因,经测序正确后,将目的片段连接至原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET30a(+)-PbQSOX。将鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,取菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析;应用镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化可溶性的rPbQSOX,并以三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)为酶反应底物分析rPbQSOX的酶活性。P QSOX大部分其他物种的同源基因。多序列蛋白比对与蛋白结构域分析结果显示,PbQSOX蛋白含1个信号肽,存在Trx1、ψErv和Erv/ALR结构域,但完全缺失了Trx2结构域。Pb QSOX蛋白含3个关键的CXXC活化基序(C为半胱氨酸Cys,X为任意氨基酸),即CPAC、CRNC和CNYC;采用MAGA5邻接法构建的系统进化树显示,PbQSOX与约氏疟原虫QSOX(PyQSOX)的亲缘关系最近;SWISS-MODEL同源建模法分析结果显示,用已知的布氏锥虫QSOX(TbQSOX)可预测PbQSOX蛋白的三级结构。PCR扩增PbQSOX基因,获得1486 bp目的条带,经测序为PbQSOX基因序列;pET30a(+)-PbQSOX质粒经NdeⅠ、HindⅢ双酶切与测序鉴定正确。SDS-PAGE和Western bloting分析结果显示,rPbQSOX重组蛋白主要以可溶形式表达,相对分子质量约59000。纯化后的rPbQSOX对TCEP的催化活性为0.84±0.18,DTT的催化活性为0.78±0.14(P<0.01)。结论PbQSOX蛋白为单Trx1结构域的伯氏疟原虫静息巯基氧化酶,构建、表达的rPbQSOX蛋白为可溶性蛋白,具有一定的静息巯基氧化酶催化活性。

重组小麦静息巯基氧化酶的表达、酶学特性及其对面包品质的影响

为发展新型面粉改良酶制剂,利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达了小麦静息巯基氧化酶(Wheat quiescin sulfhydryl oxidase,wQSOX)。将合成的wqsox基因构建至pMAL-c5x载体,并在大肠杆菌中进行表达,优化蛋白表达条件后对重组蛋白进行分离纯化及融合标签切除,获得的重组wQSOX蛋白用于酶学性质探究以及面包品质改良。结果表明,合成的截短wqsox基因包含1359 bp,编码453个氨基酸,理论蛋白分子量51 kDa;构建的pMAL-c5x-wqsox重组质粒在E.coli Rosetta gamiB(DE3)中可溶表达了重组蛋白MBP-wQSOX,其最佳表达条件为:诱导温度25℃,诱导剂IPTG浓度0.3 mmol/L,诱导时间6 h;利用Xa因子蛋白酶切除了MBP融合标签,亲和层析纯化得到了wQSOX;wQSOX可催化DTT、GSH和Cys氧化,并伴随着H2O2的生成,其中对DTT表现出最高的底物特异性;酶学性质研究发现,wQSOX最适反应温度和pH分别为50℃和10.0,在高温和碱性环境条件下表现出较好的稳定性;每克面粉中添加1.1 U wQSOX能够显著(P<0.05)提高26.4%的面包比容,降低20.5%的面包芯硬度和24.8%的咀嚼性,表现出了较好的改良面包加工品质能力。研究结果对丰富新型面粉改良酶制剂种类以及推动wQSOX在焙烤行业的应用奠定了理论基础。

血清巯基氧化酶-1、甲胎蛋白对原发性肝癌预警和诊断的队列研究

目的:探讨血清巯基氧化酶-1(QSOX-1)、甲胎蛋白(AFP)对原发性肝癌预警和诊断的价值。方法:从湖北省肝癌高危队列随访及初筛人群样本库中随机选取原发性肝癌患者(肝癌组)60例、肝硬化患者(肝硬化组)60例、慢性乙型肝炎患者(慢乙肝组)60例和正常人群(对照组)60例;另选择同期在武汉市新洲区人民医院住院治疗的60例其他恶性肿瘤患者作为其他肿瘤组,所有受试对象均于清晨空腹时抽取肘静脉血3 ml,采用化学发光法检测血清AFP含量,双抗体夹心法检测血清QSOX-1含量,对肝癌患者进行定期随访,通过绘制ROC曲线分析血清AFP、QSOX-1对原发性肝癌的预测价值。结果:血清AFP、QSOX-1在肝癌组、肝硬化组、慢乙肝组和对照组呈依次递减趋势,肝癌组血清AFP、QSOX-1显著高于肝硬化组、慢乙肝组、其他肿瘤组和对照组(P<0.05),对照组与其他肿瘤组血清QSOX-1比较差异无统计学意义(P>0.05)。有癌栓组血清AFP显著高于无癌栓组,低分化组血清AFP显著高于中分化组、高分化组,Ⅲ~Ⅳ期组血清AFP、QSOX-1显著高于Ⅰ~Ⅱ期组,肿瘤直径≥3 cm组血清AFP、QSOX-1显著高于肿瘤直径<3 cm组,各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。AFP诊断原发性肝癌的AUC为0.777,当AFP截断值为267.4 mg·L^(-1)时,其敏感度为47.5%,特异度为76.8%;QSOX-1诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.878,当QSOX-1截断值为68.75 ng·L^(-1)时,其敏感度为74.3%,特异度为77.1%;AFP、QSOX-1联合诊断肝癌的敏感度为84.5%,特异度为78.8%。AFP表达阳性组中位生存期为19.8个月,AFP表达阴性组中位生存期为31.7个月,AFP表达阳性组中位生存期显著低于AFP表达阴性组(P<0.05);QSOX-1表达阳性组中位生存期为12.7个月,QSOX-1表达阴性组中位生存期为28.7个月,QSOX-1表达阳性组中位生存期显著低于QSOX-1表达阴性组(P<0.05)。结论:随着慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌的进展,血清AFP、QSOX-1逐渐升高,血清AFP、QSOX-1联合检测能够为原发性肝癌预警和早期诊断提供依据。

妊娠合并HBV感染者血清IP-10、QSOX1水平及与母婴不良结局关系

目的:探讨妊娠合并乙肝病毒(HBV)感染孕妇血清干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)、巯基氧化酶1(QSOX1)水平与母婴不良结局关系。方法:回顾性选择2021年3月-2023年3月本院治疗的妊娠合并HBV感染孕妇86例为感染组,产前检查正常孕妇76例为对照组,检测所有孕妇血清IP-10、QSOX1水平并记录母婴结局,进行组间比较。采用多因素logistic回归模型对妊娠合并HBV感染者母婴结局的影响因素进行分析,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清IP-10、QSOX1对妊娠合并HBV感染者母婴结局评估价值。结果:感染组血清IP-10(68.52±10.46 pg/ml)、QSOX1(75.62±11.50 ng/ml)水平均高于对照组(30.22±6.66 pg/ml、45.25±7.62 ng/ml),不良母婴结局发生率(50.0%)高于对照组(17.1%)(均P<0.05)。多因素logistic逐步回归分析显示,血清IP-10(OR=1.740,95%CI 1.403~2.159)、QSOX1(OR=4.225,95%CI 2.050~8.708)均为影响妊娠合并HBV感染者不良母婴结局的因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清IP-10、QSOX1评估妊娠合并HBV感染者不良母婴结局的曲线下面积(AUC)为0.854、0.867,二者联合评估效能提高(AUC=0.925)。结论:妊娠合并HBV感染者血清IP-10、QSOX1水平均升高,且二者水平变化均是影响孕妇不良母婴结局因素,且可作为评估不良母婴结局指标。

血清QSOX1水平及其基因多态性与乙肝病毒性肝癌的遗传易感性研究

目的探讨血清巯基氧化酶1(QSOX1)水平及其基因多态性与乙肝病毒性肝癌的遗传易感性的相关性。方法本研究采用病例-对照研究方法,回顾性收集德阳市人民医院收治的200例乙肝病毒性肝癌患者(HCC)及200例种族、年龄、性别匹配的对照组为研究对象。首先利用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测两组人群血清中QSOX1的含量;利用构象差异凝胶电泳的方法将QSOX1基因启动子区的rs11589519和rs7597位点的单核苷酸多态性进行分型;利用卡方检验判断QSOX1基因型分布频率是否符合遗传平衡定律;同时分析QSOX1基因启动子区不同位点的基因多态性和等位基因型与HCC遗传易感性的相关性。分析QSOX1基因启动子区的rs11589519和rs7597位点基因多态性与HCC患者肿瘤分期的相关性。结果 HCC组血清中QSOX1的表达含量(3.48±1.82)明显高于对照组(1.91±0.78),差异有统计学意义(P <0.05),且肿瘤分期越高,血清QSOX1的含量越高。Hardy-Weinberg遗传平衡分析表明QSOX1两个基因位点的多态性均符合遗传平衡分布(r2<0.33,P> 0.05)。HCC组QSOXl位点rs11589519基因型TT频率高于对照组(38.0%vs.25.0%),rs7597基因型CT、TT频率高于对照组(48.0%vs.16.0、32.0%vs.10.0%),差异有统计学意义(P <0.05)。HCC组QSOXl基因rs11589519和rs75972位点等位基因型T分布频率均高于对照组(65.0%vs.51.0%、56.0%vs.18.0%),差异有统计学意义(P <0.05)。QSOX1基因启动子区的rs11589519位点AA型HCC患者IIIa+IIIb比率明显高于TT型患者(P <0.05)。QSOX1基因启动子区的rs7597位点TT型HCC患者Ⅲa+Ⅲb比率明显高于CC型患者,差异有统计学意义(P <0.05)。结论 QSOX1基因启动子区的rs11589519和rs7597位点多态性与HCC遗传易感性存在相关性。

肝癌患者血清中sB7-H3、GP73、QSOX-1的表达水平及临床诊断价值研究

目的 探讨肝癌患者血清可溶性B7-H3(sB7-H3)、高尔基体蛋白73(GP73)、血清清巯基氧化酶-1(QSOX-1)的表达水平及临床诊断价值。方法 选取在2018年2月至2020年2月期间来我院治疗原发性肝癌患者310例(观察组)及同期健康体检人员100例(对照组)作为研究对象。采用双抗体夹心法检测两组受试者血清中sB7-H3、GP73、QSOX-1的表达水平,并进行对比分析。结果 观察组受试者的sB7-H3、GP73、QSOX-1水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清sB7-H3、GP73、QSOX-1水平在患者的性别、年龄上差异不显著,无统计学意义(P>0.05);Ⅰ~Ⅱ期组患者的血清sB7-H3、GP73、QSOX-1水平显著低于Ⅲ~Ⅳ期组,而GP73水平却显著高于Ⅲ~Ⅳ期组,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤直径≥3 cm组患者血清GP73、QSOX-1水平显著高于肿瘤直径<3 cm组,差异有统计学意义(P<0.05);有远处转移组的肝癌患者血清sB7-H3、GP73、QSOX-1水平显著高于无远处转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。采用ROC曲线分析血清sB7-H3、GP73、QSOX-1在两组受试者的表达情况,结果显示sB7-H3、GP73、QSOX-1的曲线下面积(AUC)分别为0.930、0.820及0.817,最佳临界值分别为2 870.58 ng/mL、115.68 ng/mL及68.715 pg/mL,灵敏度分别为74.2%、73.2%、57.1%,特异度分别为93.0%、98.0%、93.0%。若sB7-H3、GP73、QSOX-1联合诊断,即其中之一为阳性即诊断为肝癌,其敏感度为84.5%,特异度为98.9%。结论血清sB7-H3、GP73、QSOX-1在原发性肝癌血清中高表达,表达水平与肿瘤直径、临床分期及是否发生远处转移有关,且sB7-H3、GP73、QSOX-1可作为原发性肝癌早期诊断的良好指标,sB7-H3、GP73、QSOX-1联合检测更能提高原发性肝癌的诊断的准确性。

人肝再生增强因子CXXC活性结构的研究

人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)蛋白序列中有一段保守的Cys-Xaa-Xaa-Cys(CXXC)氨基酸序列,针对hALRp的CXXC结构,对hALR分别进行C65A和Q88C突变,表达、纯化突变体蛋白。体外检测hALRp和突变体的黄素腺嘌呤二核苷酸(flavinadenine dinucleotide,FAD)辅助的巯基氧化酶活性,hALR-FAD和hALRQ88C-FAD组与对照组比较有显著差异(P<0.05),hALR-FAD和hALRQ88C-FAD组之间无差异;hALRC65A-FAD组与对照组比较无差异。结果显示,通过C65A突变将CXXC结构破坏后,该突变体的巯基氧化酶活性完全丧失;通过Q88C突变增加一个CXXC序列后,该突变体的巯基氧化酶活性较hALR-FAD未见明显增加;同时,FAD不仅是hALRp发挥巯基氧化酶活性必须的辅助因子,而且有助于hALRp突变体蛋白的复性。

血清QSOX-1、GSN、AFP联合检测对原发性肝癌的诊断价值

目的探讨血清巯基氧化酶1(QSOX-1)、凝溶胶蛋白(GSN)、甲胎蛋白(AFP)联合检测对原发性肝癌的诊断价值。方法选择原发性肝癌患者60例(肝癌组),乙肝、肝硬化、肝脓肿等其他肝病患者60例(肝病组),健康志愿者60例(对照组),采用ELISA法检测各组血清QSOX-1、GSN,电化学发光法检测各组血清AFP。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清QSOX-1、GSN、AFP单独或联合检测对原发性肝癌的诊断效能。结果肝癌组、肝病组、对照组血清QSOX-1、GSN、AFP水平依次降低,组间两两比较P均<0.05。血清QSOX-1、GSN、AFP单独诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.891、0.801、0.802,Youden指数分别为58.3%、53.3%、55.0%,敏感性分别为88.3%、70.0%、73.3%,特异性分别为70.0%、83.3%、81.7%;AFP+QSOX-1、AFP+GSN、QSOX-1+GSN、AFP+QSOX1+GSN联合检测诊断原发性肝癌的AUC分别为0.911、0.848、0.895、0.918,Youden指数分别为64.2%、59.2%、63.3%、65.8%,敏感性分别为88.3%、80.0%、85.0%、90.0%,特异性分别为75.8%、79.2%、78.3%、75.8%。结论血清QSOX-1、GSN、AFP联合检测可提高对原发性肝癌的诊断敏感性,优化诊断效能,对原发性肝癌的早期筛查具有一定参考价值。

QSOX1在子痫前期胎盘中的表达及其对滋养细胞凋亡和增殖功能的影响

目的:探究静息巯基氧化酶-1(quiescin sulfhydryl oxidase 1,QSOX1)在子痫前期(preeclampsia,PE)胎盘中的表达情况,QSOX1对滋养细胞的生物学行为的影响,及其参与PE发生的潜在机制。方法:收集2015年11月至2016年12月于重庆医科大学附属第一医院产科住院行选择性剖宫产术的孕妇的胎盘组织,包括正常足月妊娠组(31例)和PE组(35例)。正常氧条件下,人绒毛外滋养细胞系(human transformed primary extravillous trophoblast cell line,HTR8/SVneo)细胞分为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)阴性对照组(siControl)和QSOX1特异siRNA干扰组(siQSOX1),每组6例样本,实验重复3次。缺氧条件下,HTR8/SVneo细胞分为4组,分别为正常氧处理组(0 h)、缺氧6 h处理组(6 h)、缺氧12 h处理组(12 h)和缺氧24 h处理组(24 h),每组各6例样本,实验重复3次。采用Western blot法检测正常孕妇与PE孕妇胎盘中QSOX1的差异表达以及HTR8/SVneo细胞缺氧处理后QSOX1和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的蛋白表达。利用siRNA技术干扰HTR8/Svneo细胞QSOX1的表达,用Western blot法检测转染细胞活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved caspase)相关蛋白和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达水平。并利用流式细胞术检测转染细胞凋亡,比色法检测转染细胞的增殖情况。结果:QSOX1在PE胎盘中的表达明显高于正常胎盘(0.955±0.285 vs. 3.921±0.960)(P=0.001)。缺氧处理HTR8/SVneo细胞后QSOX1和HIF-1α的表达均明显升高(1.183±0.160 vs. 3.987±0.098;1.051±0.444 vs.1.912±0.118)(均P=0.000)。下调QSOX1后HTR8/SVneo细胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达明显减少(2.940±0.514 vs. 1.075±0.121;9.223±1.230 vs. 1.011±0.019)(P=0.004;P=0.000),而CyclinD1的蛋白表达增加(1.851±0.972vs. 4.189±0.399)(P=0.018)。QSOX1干扰后HTR8/SVneo细胞凋亡能力减低[(21.007±2.214)%vs.(10.057±0.388)%](P=0.001),增殖能力增加(0.389±0.162 vs. 1.401±0.059)(P=0.020)。结论:QSOX1高表达引起滋养细胞凋亡增加和增殖减少,可能参与PE的发生。

多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达研究

真核生物的许多蛋白富含二硫键。由于大肠杆菌细胞质中含有二硫键还原酶,利用大肠杆菌生产具有生物活性的重组二硫键蛋白充满挑战。近年来,SHuffle菌株、超氧化性细胞的相继问世,利用分子伴侣或引入二硫键从头形成体系,使多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达成为可能。简要概述了野生型大肠杆菌细胞周质和经遗传改造的工程菌细胞质中二硫键的形成机制,并着重介绍了近年来重组二硫键蛋白表达策略的最新研究进展,对利用大肠杆菌反应器生产富含二硫键蛋白起指导意义。

C4ST-1在大肠杆菌中的可溶性表达

软骨素-4-O-硫酸转移酶-1(Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1,C4ST-1,EC 2.8.2.5)催化软骨素N-乙酰半乳糖胺(N-Acetylgalactosamine,GalNAc)4号位羟基硫酸化生成硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)。C4ST-1含3对二硫键,在Escherichia coli细胞质内二硫键难以正确形成,故在E.coli中表达时主要以包涵体形式存在。为提高胞内可溶性蛋白质的表达水平,共表达了催化二硫键从头形成的巯基氧化酶(Erv1p)或/和促进二硫键正确折叠的二硫键异构酶(DsbC)。结果表明共表达DsbC可使C4ST-1融合蛋白的胞内可溶性表达水平显著提高,但C4ST-1和Erv1p共表达对胞内可溶性蛋白质的表达影响相对较小。C4ST-1和Erv1p或C4ST-1和DsbC共表达菌株的酶活分别为原始菌株的1.30和2.33倍,活力达到(12.32±0.76)U/L和(21.99±0.42)U/L。挑取同时共表达C4ST-1、Erv1p和DsbC的菌株进行摇瓶水平和3 L发酵罐放大培养,酶活分别达到(29.12±0.66)U/L和49.97 U/L。本研究为C4ST-1的大规模应用奠定了一定的基础。

QSOX1、CXCL10、β2GPI 在乙型肝炎病毒相关性肝病 患者中的表达及相关性研究

目的研究巯基氧化酶1(QSOX1)、趋化因子配体10(CXCL10)、β2糖蛋白I(β2GPI)在乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝病患者中的表达及相关性。方法选取2019年3月—2020年3月在长沙市第一医院接受治疗的120例HBV相关性肝病患者,其中40例慢性乙型肝炎(乙肝)为慢性乙肝组,40例HBV相关肝硬化患者为肝硬化组,40例HBV相关性肝癌患者为肝癌组,40例非HBV感染肝病患者为非HBV肝病组,选择40例同期无HBV感染的健康体检志愿者为正常组。检测所有入选者丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、QSOX1、CXCL10、β2GPI。结果失代偿期肝硬化患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT、TBIL水平分别高于代偿期肝硬化患者、正常组和非HBV肝病组(P<0.05)。随着慢性乙肝患者严重程度增加,QSOX1、CXCL10、β2GPI、TBIL水平逐渐升高(P<0.05)。肝癌、肝硬化、慢性乙肝组QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT水平均高于正常组和非HBV肝病组;其中肝癌患者QSOX1、CXCL10、β2GPI表达最高,ALT水平降低(P<0.05)。QSOX1、CXCL10、β2GPI与肝功能指标(ALT、TBIL)呈正相关。结论QSOX1、CXCL10、β2GPI可作为反映HBV相关性肝病患者肝脏炎性损伤程度的重要指标,与患者肝功能损伤有一定的相关性,可能参与HBV相关性肝病的发生和发展。

一种用于proCPB可溶性表达的新型表达系统

目的:构建一种新型可溶性表达系统,实现包括重组猪羧肽酶原B(proCPB)在内的目标蛋白的可溶性表达。方法:通过筛选不同来源的蛋白质二硫键异构酶并与巯基氧化酶进行共表达,并添加N末端标签对这两种蛋白的表达进行优化。结果:在大肠杆菌中,ERV1-TrxsPDI系统与目的蛋白共表达可实现目的蛋白的可溶性表达,且不受到启动子和诱导剂的限制,在重组蛋白生产和新酶工程挖掘等领域具有应用前景。

乳腺癌细胞QSOX1的CRISPR/Cas9基因编辑及其对增殖侵袭的影响研究

目的:乳腺癌细胞的恶性增殖和易于侵袭转移特性与其对患者的危害直接相关,因此,探究其产生的分子机制,对其有效防治具有重要意义。静息巯基氧化酶-1(QSOX1)是巯基氧化酶家族成员之一,有研究证明其对细胞内蛋白质折叠过程中二硫键形成及细胞外基质的形成发挥重要作用。由于QSOX1在乳腺癌和胰腺癌等多种癌细胞中过表达,将探索QSOX1对乳腺癌细胞过度增殖和侵袭转移方面的可能作用。方法:通过利用CRISPR/Cas9技术构建QSOX1基因敲除和敲入的乳腺癌细胞模型,检测分析QSOX1对乳腺癌细胞MCF-7的分裂增殖、侵袭迁移能力等方面的影响。结果:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了QSOX1基因敲除和敲入的乳腺癌MCF-7细胞株,其与对照野生型组细胞相比,QSOX1基因敲除株的增殖能力显著下降,癌细胞在体外的迁移和侵袭能力受到明显抑制;而QSOX1基因敲入株的增殖能力和体外迁移侵袭能力却明显有提高。结论:初步揭示了QSOX1在癌症发生与发展中的作用,为进一步阐明其作用的分子机制和设计靶向药物奠定了重要基础。

肝癌进展过程中QSOX-1的动态变化及意义

目的检测广西肝癌高危队列中新发的肝癌、肝硬化、肝炎、正常对照组等研究对象血清中巯基氧化酶-1(Quiescin sulfhydl oxidase-1,QSOX1)的表达水平,分析肝癌患者血清QSOX1变化与临床病理特征的关系,探讨QSOX1与甲胎蛋白(AFP)联合检测对肝癌的预警和诊断意义。方法对广西肝癌高发区肝癌高危队列定期进行复查随访;将队列中陆续新发的肝癌、肝硬化、肝炎患者分别组成肝癌组(PLC组)、肝硬化组(LC组)、肝炎组(Hep B组),并匹配正常对照组(NC组),PLC患者组分别在术前、术后做自身对照,应用ELISA定量检测法测定血清中QSOX1的浓度。结果 QSOX1在NC组、Hep B组、LC组、PLC组分别呈依次递增趋势,PLC组血清QSOX1浓度明显高于LC、Hep B、NC组,总体组间差异具有统计学意义(F=27.674,P=0.000);PLC组患者术后QSOX1浓度明显低于术前平均水平,差异具有统计学意义(t=4.6,P<0.05);肝癌患者血清QSOX1水平与肿瘤直径相关,与性别、年龄、是否有癌栓、AFP水平及是否复发等临床病理特征均无显著相关性(P>0.05);QSOX1单独鉴别诊断肝癌和肝硬化时,灵敏度和特异度分别为70%和71%,QSOX1与AFP联合诊断的灵敏度为83.33%,特异度为77.78%。结论肝癌高危人群血清中QSOX1表达水平随着向肝炎、肝硬化、肝癌进展而显著升高,术后降低至常态,QSOX1与AFP联合诊断的灵敏度和特异度显著增高,提示QSOX1检测尤其QSOX1联合AFP检测对于肝癌的预警和诊断有良好的参考价值。

肝细胞生成素家族的分子生物学特性及作用机制研究进展

人们对肝细胞生成素 (HPO)及其家族的认识起源于对肝再生现象的研究。越来越多的证据表明 ,在自然界中存在一个HPO家族。近年来 ,人们对该家族的分子 :E10R、ERV、9GL、HPO等进行了系统的分子生物学研究 ,该家族的分子具有巯基氧化还原酶的功能 ,在细胞质内参与二硫键的形成 ,对细胞的生长。