细胞内总游离巯基氨基酸的测定及其对不同作用机制药物的识别作用

建立了一种灵敏、特异的离线柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定细胞内4种总的游离巯基氨基酸。以三-(2-羧乙基)膦(TCEP)为还原试剂、7-氟-2,1,3-苯唑-4-磺酸(SBD-F)为衍生试剂、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸(MPG)为内标,经衍生后,在C18色谱柱上分离,12min内4种巯基氨基酸得到良好的基线分离,且其浓度与相对色谱峰面积呈良好线性关系,相关系数在0.9995～0.9998之间。结果表明,该方法具有良好的精密度、宽的线性范围及较低的定量限,适用于生物样本的测定。用此方法测定了HeLa细胞在长春新碱(25nmol/mL)及丝裂霉素(75nmol/mL)干预24h后细胞内4种巯基氨基酸,正常培养组为对照。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)结果表明:细胞内4种巯基氨基酸能够将药物干预组与对照组之间、两个药物干预组之间很好地区分开,这种模式识别是代谢组学研究方法对药物作用机制模式识别的一种新的尝试,并希望通过这种方法找到与疾病或药物作用相关规律,用于计算机辅助药理学的研究。

一种巯基氨基酸响应荧光探针的合成及检测应用

目的:以7-羟基香豆素为原料合成的化合物SP作为荧光探针应用于巯基氨基酸的检测。方法:7-羟基香豆素和2,4-二硝基氟苯反应合成得到化合物SP,通过荧光增强实现巯基氨基酸的灵敏检测。结果:在探针SP的溶液中加入巯基氨基酸后(谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸),探针荧光逐渐增强,此探针响应时间较短,20 min达到荧光平台区;且加入其它种类氨基酸或常见离子,探针荧光强度未呈现明显变化。结论:合成的探针SP能够实现巯基氨基酸的检测,且具有良好的选择性。

β-巯基氨基酸的合成与应用

自然化学连接(Native chemical ligation, NCL)是蛋白质化学合成中里程碑式的重要反应. 在温和的中性水相缓冲液中, 通过自然化学连接可以将N端为半胱氨酸的多肽与C端为硫酯的多肽连接合成带有修饰的蛋白质. 天然蛋白质的半胱氨酸丰度仅为1.7%, 导致难以找到合适的半胱氨酸反应位点, 阻碍了NCL的广泛应用. “自然化学连接-脱硫”的策略首次将连接位点拓展到丙氨酸, 启发了化学家们通过不同类型的β-巯基氨基酸来介导NCL反应, 随后通过脱硫反应可以得到天然多肽序列, 为蛋白质的合成提供更多选择. 近年来, 多个课题组完成了β-巯基苯丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的合成, 并应用NCL-脱硫策略合成蛋白质. 将对上述β-巯基氨基酸合成与应用予以综述.