水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达

将水稻巯基蛋白酶抑制剂 (Oryzacystatin,OC) c DNA基因克隆、测序分析后 ,与烟草 (N icotiana tabacum L .)叶绿体 16 S r DNA基因启动子和 T393终止子构建表达盒 ,与抗壮观霉素选择标记基因 aad A表达盒相连 ,以烟草叶绿体基因组同源片段 rbc L和 ORF5 12一起构建成叶绿体转化载体 p ZOC。通过基因枪轰击烟草幼苗叶片 ,壮观霉素筛选 ,获得转化再生植株。经 Southern、 Western检测及子代遗传学分析实验证明 OC基因已整合到烟草叶绿体中 ,并且可以遵循非孟德尔的母性遗传规律稳定遗传给后代。

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆与序列分析(英文)

对多种已知植物巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的氨基酸序列进行比对分析,根据其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物,并从茶树品种龙井43鲜叶中提取总RNA,用RT-PCR法扩增出-204 bp的cDNA特异片段,然后通过3'/5'RACE的方法,分别扩增出3'端和5'端的序列,从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列,所得序列全长627 bp,编码101个氨基酸,分子量约11.062 KDa.该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的QXVXG结构,且经Blast分析表明,该基因序列与其他植物巯基蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列同源性为54%～77%.

水稻巯基蛋白酶抑制剂的纯化及其性质研究

水稻的糠皮和胚经生理盐水浸取、离心后的上清液加热至８０℃处理１０ｍｉｎ，离心获得的上清液调ｐＨ至８．０，得到沉淀。沉淀溶解于０．０１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ，经透析冷冻干燥得水稻巯基蛋白酶抑制剂（ＣＰＩ）粗品；粗品再经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱线性离子梯度洗脱和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱分子筛层析，即可获得在ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＨＰＬＣ上均为单一蛋白带的ＣＰＩ样品。经上述步骤，ＣＰＩ可被纯化５８倍。经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量均为１２０００，Ｎ末端氨基酸为Ｐｒｏ，等电点５．６．水稻ＣＰＩ经１００℃处理１０ｍｉｎ后，其抑制活性无任何变化，在ｐＨ２．０～９．０之间，活性也不发生改变，但ｐＨ在９．０以上，其活性逐渐下降，水稻ＣＰＩ对木瓜蛋白酶是一种高亲和性的抑制剂，它对木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶有强抑制作用，对菠萝蛋白酶仅有弱抑制作用，但对胰蛋白酶则全无抑制作用；其抑制类型属竞争性抑制剂类型，Ｋ＿ｉ值约３．５×１０￣（－８）ｍｏｌ／Ｌ对木瓜蛋白酶的抑制摩尔比约为１：１。

百合巯基蛋白酶抑制剂的纯化及部分性质研究

百合的鳞茎中含有一种对木瓜蛋白酶有强抑制作用的巯基蛋白酶抑制剂．百合的鳞茎经浸取加热处理，木瓜蛋白酶偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱亲和层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００分子筛层析，可获得在ＰＡＧＥ和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ均为单一蛋白带的百合巯基蛋白酶抑制剂（ＣＰＩ）．此ＣＰＩ为单链蛋白，含有０．３０７％的中性糖；Ｎ端氨基酸为Ｉｌｅ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得亚基分子量为１２０００；ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００测得分子量为１２５００．百合ＣＰＩ在１００℃内和ｐＨ２～１２范围内非常稳定；对木瓜蛋白酶的抑制属竞争性抑制类型，其Ｋｉ值为１．１５×１０^（－９）ｍｏｌ／Ｌ，对木瓜蛋白酶的抑制摩尔比为８．５：１．

急性心肌梗塞病人血清巯基蛋白酶抑制肽C的变化

采用兔抗人ＣｙｓｔａｔｉｎＣ抗体建立了酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）技术，对急性心肌梗塞病人急性发作期、恢复期及正常对照进行了测定。发现心梗急性发作期和恢复期血清ｃｙｓｔａｔｉｎＣ含量无明显变化，但均明显低于对照（Ｐ＜０．０ｌ）。用Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归模型校正年龄因素的影响后，上述差别仍然显著（Ｐ＝０．０４１）。提示血清ｃｙｓｔａｔｉｎＣ浓度变化在一定程度上可作为急性心肌梗塞诊断的参考指标。此检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好。

二巯丙磺钠对百草枯急性中毒大鼠肺组织基质金属蛋白酶-9 mRNA及其金属蛋白酶组织抑制剂-1 mRNA表达的影响

目的探讨二巯丙磺钠(DMPS)救治百草枯(PQ)急性中毒大鼠作用机制。方法120只雄性SD大鼠随机分为正常对照组,DMPS(200mg.kg-1,ip)对照组,PQ急性中毒(20mg.kg-1,ip)1,3,7,14和28d组以及DMPS干预(先给DMPS,15min后再给PQ)1,3,7,14和28d组。应用RT-PCR技术检测PQ急性中毒组大鼠及DMPS干预组大鼠肺组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA和金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)mRNA的表达。结果PQ急性中毒组早期肺组织毛细血管扩张充血,炎症细胞浸润,后期出现较大范围慢性炎症病灶,纤维组织增生。与正常对照组比,MMP-9mRNA明显升高,分别为1.13±0.06,1.32±0.04和1.10±0.06,0.85±0.06和0.75±0.05,TIMP-1mRNA明显升高,分别为1.14±0.08,1.29±0.05,1.61±0.09,1.83±0.13和1.73±0.08;7,14和28d MMP-9mRNA/TIMP-1mRNA比值明显低于正常对照,分别为0.68±0.03,0.46±0.04和0.43±0.06;DMPS干预后,MMP-9mRNA1,3和7d和TIMP-1mRNA1,3,7,14和24d表达低于PQ中毒组,MMP-9mRNA分别为1.05±0.03,1.17±0.05和0.93±0.09;TIMP-1mRNA分别为10.0±0.07,1.15±0.09,1.09±0.06,1.16±0.08和1.23±0.09;MMP-9mRNA/TIMP-1mRNA比值略低于DMPS对照组,但高于PQ中毒组,分别为0.85±0.05,0.63±0.04和0.58±0.02(均P<0.05)。结论DMPS可能通过下调大鼠肺组织MMP-9mRNA和TIMP-1mRNA表达,上调肺组织MMP-9mRNA/TIMP-1mRNA比值发挥救治PQ中毒作用。

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂（CPI）基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签（EST）序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和[LVI]-[AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[EDQV]-[HYFQ]序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.

巯基蛋白酶抑制肽促进乳鼠心肌细胞贴壁和生长

观察了鸡巯基蛋白酶抑制肽Ⅱ型(CPI_C-Ⅱ)对培养乳鼠心肌细胞生长的影响,结果显示:80μg/mlCPI_C-Ⅱ在接种后8小时内能使细胞贴壁增加67％。100mg/mlCPI_C-Ⅱ与心肌细胞一起温育24小时后能促进DNA合成增加76％。在促进DNA合成方面还与其他生长因子有协同作用,100μg/mlCPI_c-Ⅱ可使胰岛素的作用提高到135.4％～140.5％,可使0.01ng/ml表皮生长因子EGF促进DNA合成的作用增高123.2％。

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR法扩增出茶树中巯基蛋白酶抑制剂基因(Tea cystatin,TC)cDNA编码区序列,定向克隆到表达载体pET 32 a(+)上,得到重组质粒pET-TC,在表达宿主菌BL21 trxB(DE3)中高效表达,产生分子量约为31.8 kD a的特异融合蛋白。实验表明:随着诱导时间的延长,表达的融合蛋白Trx-TC的产量逐渐增加,特异蛋白的表达量最高可占菌体总蛋白的35.4%;在15℃、25℃、30℃和37℃四个不同诱导温度下,均能诱导产生融合蛋白;IPTG终浓度在0.5 mm ol/L^5 mm ol/L范围内均能诱导产生融合蛋白,表达的产物主要以可溶性蛋白形式存在。另外,体外酶促反应表明表达的融合蛋白Trx-TC对木瓜蛋白酶有明显的抑制活性。

水稻巯基蛋白酶抑制剂的分子修饰与其对稻瘟病菌的抑制作用

水稻巯基蛋白酶抑制剂（ＣＰＩ）经用二硫苏糖醇，对氯汞苯甲酸和碘乙酸修饰后，对木瓜蛋白酶的抑制活性并无改变；用Ｎ－乙基顺丁烯二酰亚胺与ＣＰＩ反应，可以测出ＣＰＩ分子内有１９个巯基被修饰，被修饰后，抑制活性仍无改变，表明水稻ＣＰＩ的抑制活性不需要巯基参与；应用Ｎ－溴代丁二酰亚胺与ＣＰＩ反应，可测出ＣＰＩ分子内有２个Ｔｒｐ被修饰，修饰后，抑制活性全部丧失，表明Ｔｒｐ是保持抑制活性所必需的基团。水稻巯基蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂对稻瘟病菌丝体的生长均有抑制作用，但后者的抑制作用比前者更强，若将两种抑制剂混合使用，则对稻瘟病菌丝体的抑制作用非常强烈；当抑制剂加入量达７２μｇ时，即可产生明显的抑制作用。

巯基蛋白酶抑制剂对胃癌体外侵袭转移的影响

目的 :观察不同巯基蛋白酶抑制剂对不同恶性度胃癌细胞株体外侵袭转移力的影响。方法 :用体外粘附法和 Boyden小室模型法观察外源性巯基蛋白酶抑制剂 E- 6 4和内源性抑制剂胱蛋白 A(Cystatin A)对高分化胃腺癌 MKN2 8细胞株和低分化胃腺癌 MKN45细胞株细胞体外的侵袭转移能力。结果 :E- 6 4和Cystatin A抑制二胃癌细胞株体外的细胞粘附力和细胞对基质胶 (matrigel)的侵袭力 ,对 MKN2 8细胞的作用较 MKN45细胞明显。结论 :巯基蛋白酶 Cathepsin B参与胃癌的侵袭转移过程 。

检测肾小球滤过功能的新方法——血清巯基蛋白酶抑制肽C

目的探讨测定血清巯基蛋白酶抑制肽C(CysC)的方法并评价其检测肾小球滤过功能的价值。方法对照组 2 1例、患者 10 7例 ,用全自动生化分析仪检测CysC、血清肌酐 (Scr)、尿肌酐 ,计算肌酐清除率 (Ccr)。根据Ccr将患者分成 4组。CysC用颗粒增强透射免疫比浊法 ,肌酐用肌氨酸氧化酶 PAP法测定。结果对照组CysC浓度为 1 2 5± 0 14mg/L ,患者组CysC随Ccr下降而升高 ,各组间差异显著 (P <0 0 0 1)。CysC与Ccr的相关性优于Scr与Ccr的相关性。CysC与性别、年龄无相关 ,而Scr男性显著高于女性 (P <0 0 0 1)。受试者工作特征 (ROC)曲线分析 ,CysC区别正常或异常肾功能的准确性较高 ,优于Scr。结论检测肾小球滤过功能CysC较Scr更好 ,不受年龄、性别的影响 ;本法可大批量、快速、准确测定 ,适于临床常规应用。

绵农小麦种子巯基蛋白酶抑制剂的纯化及性质研究

绵农11号小麦种子磨粉后的胚和麸皮，经溶液浸取和硫酸铵分级沉淀获得巯基蛋白酶抑制剂（CPI）粗品，再经木瓜蛋白酶－Sepharose4B亲和层析，DEAE－Sepharose离子交换层析和SephadexG－100分子筛层析，可获得两种CPI．通过SDS－PAGE或凝胶过滤法测得其Mr分别为18800［简称CPI（H）］和10500［简称CPI（L）］．它们在PAGE，SDS－PAGE和HPLC上均为单一蛋白带．CPI（L）和CPI（H）对木瓜白酶的抑制活性（ID50）分别为7．8×10－6mol／L和3．40×10－6mol／L．对无花果蛋白酶的抑制活性分别为9．5×10－5mol／L和5．8×10－6mol／L；CPI（H）对菠萝蛋白酶有弱抑制作用，但CPI（L）则无抑制作用；无论是CPI（L）或CPI（H）对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶均无抑制作用．CPI（H）的N－末端为Ile．CPI（H）和CPI（L）在pH2．0～11．0范围内和90℃处理5min，两种CPI的抑制活性均无变化；CPI（H）和CPI（L）对木爪蛋白酶的抑制曲线经Dixon作图法，得出CPI（H）为反竞争性抑制类型，而CPI（L）为竞争性抑制类型，其Ki值为8．32×10－6mol／L．

河北毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

植物巯基蛋白酶抑制剂（eysteine proteinase inhibitor,CPI）在林木的抗虫基因工程中发挥着越来越重要的作用，分离和克隆植物CPI基因进而研究该基因的功能是CPI基因工程研究的热点。本文应用PCR技术从我国乡土抗天牛树种河北毛白杨形成层中分离和克隆到了一个710bp大小的eDNA片段，同时对序列进行测定和分析。测序和分析结果表明，该eDNA片段含有一个429bp的完整开放阅读框，其编码143个氨基酸残基，具有LARFAVDEHN、QXVXG和YEAKVWVKPW三个典型的植物巯基蛋白酶抑制剂基因家族的高保守区段，同时在GenBank中进行了注册，核苷酸注册号为DQ020096，氨基酸注册号为AAY41807。氨基酸序列同源性分析表明，该基因与其他林木中的巯基蛋白酶抑制剂的同源性差异较大，同源性在48％-97％之间，其中与欧洲山杨的同源性最高，达到97％，与猕猴桃的同源性最低为48％。说明河北毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达，这为进一步研究该基因的抗虫功能奠定了良好的基础。

水稻巯基蛋白酶抑制剂研究进展

综述水稻巯基蛋白酶抑制剂 (Oryzacystatin ,OC)近年的研究进展。巯基蛋白酶抑制剂 (CPI)统称为胱蛋白超家族。OCI含有CPI家族的典型保守序列Glu -Val-Val-Ala -Gly ,这是其抑制活性不可缺少的区段。利用水稻cDNA文库还克隆得到OCII。OCI与OCII之间在序列上有高度的同源性 ,但在对蛋白酶的抑制作用上有显著差异。OC对鞘翅目昆虫有较强的抗虫性。在抗病方面 。

3种巯基蛋白酶对去磷酸化牛乳β-酪蛋白和茶黄素复合膜的清除

目的:采用茶黄素(theaflavin,TF)和去磷酸化牛β-酪蛋白(dephosphorylated bovineβ-casein,Dβ-CN)在芯片表面形成蛋白质/色素复合膜的模型,评估3种巯基蛋白酶(cysteine proteases,CPs),木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶,对Dβ-CN/TF复合膜的清除作用。方法:在消散石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)上建立Dβ-CN/TF复合膜,Boltzman方程评估3种CPs水解复合膜的效率,水解前后膜变化通过原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)和接触角表征。结果:3种CPs水解复合膜的效率由大到小依次为无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶(P<0.05)。AFM图和接触角表征结果证实,CPs能够有效地清除结合在Dβ-CN表面的TF。结论:CPs具有在牙色渍清除中潜在的应用价值。在开发口腔保健产品中该类酶值得进一步研究。

血清巯基蛋白酶抑制肽C诊断肾功能损害的价值

目的探讨血清巯基蛋白酶抑制肽C(CystatinC ,CysC)诊断肾功能损害的价值。方法10 7例病人分别测定CysC、血清肌酐、尿肌酐、内生肌酐清除率 (Ccr)、尿白蛋白、尿视黄醇结合蛋白、尿α1 微球蛋白。以 2 1例健康人作对照 ,根据矫正的Ccr将病人分为 4组。CysC用颗粒增强透射免疫比浊法测定。以Ccr作标准 ,<80ml.min-1/ 1.73m2 为肾功能减退 ,比较各指标检测肾功能损害的敏感性、准确性及与Ccr的相关性。结果正常血清CysC浓度为 1 2 5± 0 14mg/L ,患者各组间差异有显著意义 ;Ccr与上述指标呈负相关 (r分别为 - 0 75 7、- 0 6 4 2、- 0 392、- 0 385、- 0 5 2 1,P <0 0 1) ,Ccr与CysC的相关性优于Ccr与其余指标的相关性 ,CysC的敏感性和准确性较佳。结论 (1)CysC发现肾功能损害较敏感。 (2 )CysC有可能成为检测肾小球滤过功能新的内源性标志物。 (3)用颗粒增强透射免疫比浊法测定CysC ,简便易行 ,迅速及时 。

玉米巯基蛋白酶抑制剂的纯化及部分性质

从玉米种子纯化出两种巯基蛋白酶抑制剂（ＣＰＩⅠ和ＣＰＩⅡ），分子量分别为９５００和１３０００，它们都只抑制巯基蛋白酶的水解活性，而对丝氨酸蛋白酶则无抑制作用，属于巯基蛋白酶水解抑制剂，它们在ｐＨ３．０～１１．０或１００℃温度范围内保有１００％的抑制木瓜蛋白酶的抑制活性，表明在这些外界条件下其分子非常稳定．

用聚焦层析法纯化人巯基蛋白酶抑制肽C-hCRI_c

以肾衰病人尿为材料,通过碱变性、酸变性和热变性除去部分杂质和尿蛋白。然后用羧甲基-木瓜蛋白酶-琼脂糖4B亲和层析,最后用多缓冲剂聚焦层析,把人的巯基蛋白酶抑制肽C(human cysteine proteinase inhibitor C,简称 hCPI_C)和其他的hCPI_C分开,制备得高纯度、高活性的hCPI_C。在SDS-PAGE中为均一条带,每mg蛋白可抑制50单位木瓜蛋白酶活性的50-63％。