β-N-乙酰氨基己糖苷酶产生菌的筛选与产酶条件

筛选了真菌、细菌和放线菌共1121株,其中有β-HexNAcase 活力的有237株,在所筛选菌中只要有β-GlcNAcase 活力,也就有β-GalNAcsse 活力,但两酶比值(β-GlcNAcsse/β-Gal-NAcsse)不同。所筛选出的溜曲霉(Asg.tamarii)S215为由土壤中分离的,其产酶最适条件为5%麸皮液体培养基,28—30℃振荡培养5—6天,补充碳源如纤维二糖、葡萄糖胺、半乳糖胺或者补充氮源(NH_4)_2SO_4及 NH_4NO_3可以稍稍提高酶活。在溜曲霉的培养液中除β-GlcNAcase 及β-GslNAcase 外,还有α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-岩藻糖苷酶及α-甘露糖苷酶。

简并引物法克隆保加利亚乳杆菌β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(β-Hexcase)在细菌、植物和动物中广泛存在,具有典型的外切酶活性并可以催化切除β-N-乙酰氨基己糖的非还原性氨基己糖残基,在细菌细胞分裂中具有重要作用.选取与保加利亚乳杆菌LJJ亲缘关系近的菌种的β-N-乙酰氨基己糖苷酶蛋白序列,利用ICO-DEHOP和CODEHOP在线简并引物设计软件设计β-Hexcase简并引物,选取Hex1-f和Hex1-r引物对,以LJJ基因组DNA为模板经PCR扩增得到614 bp产物.PCR产物连接pGEM-T质粒载体后克隆至大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆提取质粒进行测序.测序结果显示产物长度为614 bp,该DNA序列经blastx比对发现与其他已知β-Hexcase基因具有相似性,表明所克隆的序列即为LJJβ-Hexcase的基因片段.β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的获得为进一步研究β-N-乙酰氨基己糖苷酶与保加利亚乳杆菌自溶的关系奠定了基础.

大气细颗粒物(PM_(2.5))对肥大细胞分泌β-氨基己糖苷酶、组胺和IL-4的影响

目的探究大气细颗粒物(PM_(2.5))对肥大细胞的生物学效应。方法采用智能中流量空气总悬浮微粒采样器采集重庆市内非工业区空气中PM_(2.5),以不同浓度(0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0μg/m L)PM_(2.5)混悬液作用于人肥大细胞系LAD2,采用微板法检测LAD2细胞β-氨基己糖苷酶的释放水平;采用ELISA法检测LAD2细胞释放组胺、白细胞介素4(interleukiin-4,IL-4)以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果终浓度为25.0μg/m L的PM_(2.5)刺激后,LAD2细胞分泌并释放入细胞上清的β-氨基己糖苷酶、组胺及IL-4的水平高于0μg/m L PM_(2.5)组[(23.78±3.98)%vs(14.05±1.12)%,(12.32±0.18)vs(9.72±0.23)μg/m L,(267.63±7.97)vs(154.25±7.71)pg/m L,P<0.01];12.5~100.0μg/m L PM_(2.5)刺激后,LAD2细胞产生ROS水平逐渐升高,终浓度为25.0μg/m L的PM_(2.5)刺激LAD2细胞后产生的ROS水平高于0μg/m L PM_(2.5)组[(7.99±0.29)vs(5.88±0.49)ng/m L,P<0.01]。结论 PM_(2.5)可能通过氧化应激致使肥大细胞产生ROS,引起肥大细胞产生细胞因子和炎症因子。

烧伤后血清β－N－乙酰氨基己糖苷酶变化及其临床意义

烧伤后血清β－Ｎ－乙酰氨基己糖苷酶变化及其临床意义ＣｈａｎｇｅｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＮ－Ａｃｅｔｙｌ－β－Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｉｎｂｕｒｎｅｄｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ刘德贵，杨宗城，黎鳌（第三...

尿氨基己糖苷酶对乙醇性肝病的诊断

目的:检测乙醇性肝病(ALD)患者尿氨基己糖苷酶(uHex),并与血清中的%缺糖基转铁蛋白(%CDT)与总转铁蛋白(Tf)的比值、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、平均红细胞容积(MCV)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等指标比较,评价其对ALD的诊断价值。方法:选择健康不饮酒对照组、非乙醇性肝病的其他肝病组(NALD组)、ALD组(三组均为男性),分别检测uHex,%CDT,GGT,MCV,ALT,AST等指标,各指标在不同组间的比较用F检验;各项目之间的关系研究用直线相关,计算相关系数;同时绘制各指标的ROC曲线。结果:ALD组中的uHex显著高于对照组,但与NALD组无显著性差异。uHex诊断ALD的ROC曲线下面积为0.737,敏感度为0.60,特异度为0.76,而%CDT这三者分别为0.857,0.75,0.88,GGT分别为0.751,0.75,0.76,MCV分别为为0.669,0.30,0.78,ALT分别为为0.512,0.25,0.72,AST分别为为0.426,0.25,0.68。uHex与%CDT,GGT不相关,与这两者联合检测敏感度提高到1,0.9。结论:对于ALD的诊断,uHex,%CDT,GGT和MCV均具有一定的诊断价值,尤其%CDT是一个很好的辅助诊断指标,uHex也不失为一个较好的非损伤性的指标。uHex与%CDT,GGT联用可提高敏感度。

系统感染TMV的番茄叶片胞外四种β－N－乙酰氨基己糖苷酶的纯化和性质

系统感染ＴＭＶ的番茄叶胞外提取液经冰冻干燥浓缩、－２０℃丙酮沉淀、离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化，获得４种β－Ｎ－乙酰氨基己糖苷酶。这些酶是由７５ｋＤ亚基构成的电荷异构体（ｃｈａｒｇｅｉｓｏｍｅｒ），用过碘酸－Ｓｃｈｉｆｆ反应证明是糖蛋白，以Ｄ－硝基苯－Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷（ｐＮＰ－β－Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ）和ｐ－硝基苯－Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基半乳糖苷（ｐＮＰ－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ）为底物，这些酶具有相似的性质。Ｎ－乙酸氨基葡萄糖（ＧｌｃＮＡｃ）和Ｎ－乙酰氨基半乳糖（ＧａｌＮＡｃ）是这些酶的竞争性抑制剂，Ａｇ＋和Ｈｇ２＋是它们的强抑制剂，Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋和Ｃｕ２＋也抑制其活性。

血清β-N-乙酰氨基己糖苷酶自动分析法改进

目的 对血清 β N 乙酰氨基己糖苷酶总活性自动分析法进行改进 ,使其整个试验过程实现全自动。方法 利用SYNCHRONCX9ALX全自动生化分析仪的操作功能 ,对原法的试验过程、试验条件、测定参数等重新设计 ,并对本法进行评价。结果 本法的检测波长为 4 10 / 5 2 0nm ,酶促反应时间 8.2 6 6 7min ,色原PNP在4 10 / 5 2 0nm下的毫摩尔吸光系数为 18.5 ,线性达 80 0U/L ,批内CV为 0 .4 9%～ 2 .2 1% ,批间CV为 0 .6 9%～2 .93% , x± 2s参考范围为 7.5 8～ 2 8.4 6U/L。本法无须另做样品空白 ,从样品上机到结果打印一气呵成。结论 本法不但简便快捷 ,真正实现了全自动 ,而且精密度及线性优于原法。

磺(羧)-氯-硝基苯基-氨基己糖苷用于初速度法测氨基己糖苷酶活性

本发明为测定β-N-乙酰氨基己糖苷酶测性的试剂。发明物结构通式为[Ⅰ]所示,式中A为和还原性末端B相接的N-乙酰氨基葡萄糖基或N-乙酰氨基半乳糖基,X为硝基,R1～R4中至少有一个为卤素原子。

甜瓜β-氨基己糖苷酶基因家族的全基因组分析

β-氨基己糖苷酶(β-Hexosaminidase,β-Hex,EC 3.2.1.52)是生物界广泛存在的一种糖苷水解酶。通过全基因组信息鉴定甜瓜β-氨基己糖苷酶基因家族,初步在甜瓜全基因组数据库中发现5个β-Hex基因成员,采用Pfam等在线软件预测候选蛋白的结构域,去除2个不完整的基因,最后将筛选出的3个基因与拟南芥、青椒、番茄、可可树、谷子、葡萄和黄瓜的相应基因编码的蛋白序列进行进化分析比对、建立系统发生树和保守基序的预测分析。结果表明,进化树亚族成员中基序相同,并且在保守区序列高度相似;亚族之间基序差异也较小,保守区序列也具有较高相似性。

过期妊娠孕妇血清β-N-乙酰氨基己糖苷酶测定及临床意义

目的 :探讨过期妊娠孕妇血清 β N 乙酰氨基己糖苷酶 (HEX ,EC3.2 .1.5 2 )和胎盘功能状态的关系。方法 :采用自动分析法和放射免疫法分别检测 15 0例初孕妇 (其中 2 8例为过期妊娠 )血清HEX和胎盘生乳素 (hpL)水平 ,产后做胎盘病理检查。结果 :孕妇血清HEX和hpL水平和妊娠周数有关 ,妊娠 37周～ 39周处峰值 ,随妊娠周数的增加呈下降趋势 ,过期妊娠孕妇血清HEX水平和胎盘功能有关。结论

β－氨基己糖苷酶及其缺乏症

β－氨基己糖苷酶及其缺乏症镇江市环境科学研究所赵硕伟生化教研室杨利寿β－氨基己糖苷酶是存在于溶酶体中的四十余种酶之一，参与糖蛋白、糖脂、氨基多糖的降解，其作用是水解末端β－连接的Ｎ－乙酰氨基葡萄糖和Ｎ－乙酰氨基半乳糖残基。引起酶缺乏或酶功能丧失的突变...

β-N-乙酰氨基己糖苷酶及其合成寡糖的研究进展

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(EC.3.2.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,在自然界中催化简单的β-N-乙酰氨基己糖苷或复杂的寡糖链、多糖链中末端N-乙酰己糖苷键的水解,在微生物、植物和动物中广泛分布,具有重要的生物学功能。某些种类的β-N-乙酰氨基己糖苷酶在一定的人为条件下水解β-N-乙酰氨基己糖苷键的同时还具有转糖基作用,能将β-N-乙酰氨基己糖基转移到不同的羟基化合物上,合成β-N-乙酰氨基己糖苷化合物,在糖链合成上具有应用的潜力。本文综述了β-N-乙酰氨基己糖苷酶的结构和催化机制、酶的生物学功能以及酶在β-N-乙酰氨基己糖苷化合物合成中的应用,以促进β-N-乙酰氨基己糖苷酶的进一步研究和开发应用。

Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、异源表达和酶学特性

【目的】对细菌Solitalea canadensis中编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因进行克隆,通过原核表达获得重组β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并研究其酶学性质。【方法】以Solitalea canadensis基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖(pNP-β-Glc NAc)为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适p H以及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Solitalea canadensis克隆得到了β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段(Gene Bank:WP_014682183.1),全长2586 bp,重组表达所得蛋白表观分子量约为97 k Da,最适pH 6.0,最适温度42°C,但不稳定,半衰期小于5 min。该酶对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感,活性受Triton X-100和尿素的抑制。此外二糖分子也能不同程度地抑制该重组酶的活性,特异性抑制剂PugNAc(O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylideneamino)N-phenylcarbamate)对该酶的IC_(50)为2μmol/L。该重组酶蛋白除能水解对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-乙酰氨基半乳糖(pNP-β-GalNAc)外,还能对O-链聚糖核心结构Core Ⅱ末端的乙酰氨基葡萄糖进行水解。【结论】本文首次从Solitalea canadensis中克隆得到能水解末端β1-6连接的乙酰氨基葡萄糖而不能水解β1-4连接键的β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并对其进行了酶学性质研究和底物特异性分析,为开发高效特异性强的糖链分析工具酶提供理论基础。

橄榄叶提取物对肿瘤坏死因子的生成和β-氨基己糖苷酶释放的抑制作用

探讨了橄榄叶提取物对肿瘤坏死因子(TNF-α)

苍耳子含药血清对IgE致敏肥大细胞脱颗粒调控作用的实验研究

目的:探究苍耳子含药血清对免疫球蛋白E(IgE)致敏的肥大细胞脱颗粒的抑制作用和调控途径。方法:小鼠喂服苍耳子水溶液,制备含药血清;MTT法检测不同浓度苍耳子含药血清对肥大细胞活性的影响。IgE致敏肥大细胞,实验分为正常对照组、模型对照组、10%苍耳子含药血清组和富马酸酮替芬组。药物干预后,乳酸脱氢酶(LDH)法和甲苯胺蓝染色检测细胞毒性和脱颗粒率;ELISA检测细胞炎症活性介质β氨基己糖苷酶A(β-hexosaminidase A)、白三烯C4(LTC4)和组胺(histamine)的释放情况;F-actin微丝染色观察细胞形态变化。结果:苍耳子含药血清对正常肥大细胞活性无明显影响(P>0.05)。与正常对照细胞相比,模型对照组细胞毒性和脱颗粒率增加,β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的释放显著增加,细胞变形数量显著增加(P<0.01)。与模型对照组相比,10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞毒性和脱颗粒率显著降低,β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的释放显著下降,细胞变形数量显著减少(P<0.01)。结论:苍耳子含药血清可抑制肥大细胞变形、脱颗粒,并减少β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的释放。

几种常见中药注射剂对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

目的通过研究几种常见中药注射剂(TCMI)对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,探讨RBL-2H3细胞模型应用于体外评价TCMI引起类过敏反应的可行性。方法体外培养RBL-2H3细胞,血塞通等7种TCMI与其共同培养,通过中性红染色法计数脱颗粒的RBL-2H3细胞,显色法计算β-氨基己糖苷酶释放率,ELISA法检测培养上清中组胺含量,观察TCMI对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响。结果正常RBL-2H3细胞出现少量脱颗粒现象,血塞通、清开灵、双黄连、脉络宁、香丹、穿琥宁等能显著引起细胞脱颗粒;血塞通、穿琥宁和柴胡注射液能不同程度促进β-氨基己糖苷酶的释放;血塞通、清开灵注射液可显著引起RBL-2H3细胞组胺释放。结论RBL-2H3细胞脱颗粒的检测方法敏感、重复性好,其结果与临床报道有一定的相关性,提示其有评价TCMI所致的类过敏反应的潜在应用价值。

资木瓜中莽草酸对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒及抗炎作用研究

目的:探讨资木瓜总提物中莽草酸(Shikimic acid,SA)对C48/80(Compound 48/80)刺激大鼠腹腔肥大细胞(Rat peritoneal mast cells,RPMC)脱颗粒的影响及抗炎作用。方法:HPLC法进行资木瓜总提物中莽草酸成分的定性分析;采用甲苯胺蓝(Toluidine blue,TB)、免疫组化及电镜法进行RPMC鉴定;CCK-8法检测各浓度组RPMC细胞的增殖情况;底物法检测β-己糖苷酶的释放率;ELISA法检测细胞上清中组胺的含量。结果:SA在0~90μg/ml时,对RPMC生长无显著影响;与阳性对照组比较,SA能有效抑制β-己糖苷酶的释放和抑制组胺的分泌。结论:SA通过抑制C48/80刺激的RPMC脱颗粒而抑制炎症介质组胺的释放,进而发挥抗炎作用。

莽草酸抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒和组胺释放

目的研究莽草酸对大鼠RBL-2H3细胞增殖和化合物48/80(C48/80)诱导后细胞脱颗粒情况及其机制。方法MTT法检测(3、10、30)μg/m L的莽草酸处理后,RBL-2H3细胞的增殖情况,甲苯胺蓝染色观察C48/80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒的情况,底物法检测(0、12.5、25、50、80、100)μg/m L C48/80处理后,RBL-2H3细胞内β-氨基己糖苷酶的释放,ELISA检测各处理组细胞上清液中组胺的含量。结果 (3、10、30)μg/m L莽草酸对RBL-2H3细胞增殖无明显抑制作用,RBL-2H3细胞脱颗粒与C48/80的剂量有一定量效关系;莽草酸能抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒;与阳性对照组相比,莽草酸处理C48/80刺激后的RBL-2H3细胞,其β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放量均显著降低。结论莽草酸可抑制大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒,减少组胺释放。

GM2神经节苷脂沉积症的临床特征及诊断

目的探讨以慢性进行性神经系统受累为主要表现的GM2神经节苷脂沉积症的临床特征、诊断及鉴别诊断。方法对3例以慢性进行性神经系统受累为主要表现的GM2神经节苷脂沉积症患儿进行详细病史询问、体格及辅助检查,3例均行眼底、头颅MRI、氨基己糖苷酶(Hex)活性、脑电图、听觉诱发电位检查。结果3例均表现为智力运动倒退,对声音刺激有异常惊跳反应;顽固性抽搐、共济失调各2例;锥体束征均阳性;眼底检查均发现樱桃红斑,视神经萎缩1例;头颅MRI示均有脑白质病变;脑干听觉诱发电位异常1例;脑电图见癫癎波2例;Hex活性均下降。其中2例Tay-Sachs病患儿仅Hex A降低,1例Sandhoff患儿Hex A及Hex B均降低。结论儿童进行性智力运动倒退伴异常惊跳反应、视力减退、眼底樱桃红斑、顽固性抽搐及共济失调是GM2神经节苷脂沉积症的临床特点。血白细胞Hex活性检测是确诊的重要依据。

清开灵注射液及其中间品类过敏反应的实验研究

目的:研究清开灵注射液及其生产过程中的中间品对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,评价清开灵注射液及其中间品的类过敏反应。方法:将清开灵注射液以5个不同浓度稀释,其中间品以IC50浓度稀释,分别作用于RBL-2H3细胞,45 min后,底物显色法测定β-氨基己糖苷酶释放度;ELISA法测定组胺释放量。结果:不同浓度的清开灵注射液对RBL-2H3细胞脱颗粒程度并无浓度依赖性,但最高浓度下脱颗粒程度相对较高。同时,在其不同中间品中,金银花促进RBL-2H3细胞脱颗粒作用最明显。结论:在体外,不同浓度的清开灵注射液均可不同程度的引起肥大细胞脱颗粒,释放活性物质,引起类过敏反应,而金银花可能是致敏的主要成分。本研究为进一步研究清开灵注射液不良反应的作用机制提供实验依据。