巴佛洛霉素A1介导AMPK/mTOR/ULK1信号通路对脑缺血再灌注损伤小鼠的神经保护机制研究

目的探讨巴佛洛霉素A1(BAF-A1)抗小鼠脑缺血再灌注(IR)损伤的腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样激酶1(ULK1)自噬信号通路的机制。方法选择SPF级雄性小鼠40只,采用随机数表法分成假手术组(S组)、IR模型组(M组)、BAF-A1组(B组)、BAF-A1+AMPK激动剂组(B+M组),每组10只。以线栓法制备IR模型,以缺血1.5 h再灌注24 h后为评价点进行评价。结果神经功能缺失评分显示,S组无神经功能缺失,B组为(1.47±0.28)分、B+M组为(2.05±0.16)分、M组为(2.45±0.31)分,B组及B+M组均低于M组(P<0.05)。与M组比较,B组脑梗死体积比率下降(P<0.05)。与S组比较,M组CA1、CA3区有少量的核固缩核裂变、坏死的现象;与M组比较,B组CA1、CA3区的核固缩,核裂变空泡及坏死的症状改善,但B+M组拮抗了这一作用。与S组比较,M组LC3Ⅱ/Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白均升高(P<0.05);与M组比较,B组LC3Ⅱ/Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白均下降(P<0.05)。与S组比较,M组p-mTOR/mTOR、Ps757-ULK1/ULK1蛋白降低;与M组比较,B组p-mTOR/mTOR、Ps757-ULK1/ULK1蛋白均升高(P<0.05)。结论BAF-A1可能通过抑制AMPK/mTOR/ULK1信号通路,抑制小鼠脑海马区的过度自噬,从而发挥神经功能的保护性作用。

巴佛洛霉素A1抑制胃癌SGC-7901细胞中VEGF-C的表达

目的:研究巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)对胃癌细胞株SGC-7901的增殖、迁移和血管生成的影响,并探讨可能的机制。方法:巴佛洛霉素A1(10 nmol/mL)处理SGC-7901细胞后,检测液泡-ATP酶(vacular-ATPases,V-ATPases)活性及培养液pH值,并分别用CCK-8法检测对细胞增殖的影响,Transwell小室实验检测对细胞迁移能力的影响,ELISA法检测对SGC-7901细胞分泌血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)蛋白能力的影响,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测对细胞中VEGF-C mRNA和蛋白表达水平的影响。收集巴佛洛霉素A1处理后SGC-7901细胞的培养上清液与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养,观察血管成管情况。结果:与对照组相比,用巴佛洛霉素A1处理后,SGC-7901细胞的V-ATPase活性受到抑制(P<0.05),细胞外培养液的pH值升高(P<0.05),细胞的增殖和迁移能力被抑制(P值均<0.05),分泌到细胞外的VEGF-C蛋白明显减少(P<0.05),细胞中VEGF-C mRNA和蛋白的表达水平均明显下调(P值均<0.05);HUVECs的成管能力减弱(P<0.05)。结论:巴佛洛霉素A1能够通过抑制V-ATPase的活性来调控胃癌SGC-7901细胞外的酸性微环境,进而抑制肿瘤细胞的增殖,影响VEGF-C的表达、分泌和新生血管的形成。

巴佛洛霉素A1抑制胶质瘤迁移、侵袭及血管生成拟态的生物机制研究

目的研究巴佛洛霉素A1(Baflomycin A1,BAF-A1)对胶质瘤细胞增殖、侵袭迁移和血管生成拟态(vasculogenic mimicry,vm)的影响及其作用机制探讨。方法(1)利用巴佛洛霉素A1(10nmol/mL)处理胶质瘤细胞系U87和U251后,检测各组液泡-ATP酶(vacular-ATPases,V-ATPases)活性及培养液PH值,利用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。(2)利用三维培养技术和Transwell小室观察各组细胞VM形成状态和侵袭能力。(3)采用western-blot法探究各组细胞中PI3K/AKT的表达水平。结果(1)与对照组相比,使用巴佛洛霉素A1处理后,U87和U251细胞的V-ATPase活性受到抑制(P<0.05);细胞外培养液的PH值升高(P<0.05);细胞的增殖和迁移能力被抑制(P<0.05);血管生成拟态能力减弱(P<0.05)。(2)与对照组相比,使用巴佛洛霉素A1处理后,U87和U251细胞的PI3K、AKT蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05)。结论巴佛洛霉素A1通过抑制V-ATPase的活性来改变肿瘤的迁移、侵袭和血管生成拟态,其可能与PI3K/AKT等相关信号通路相关。

IL-6促进自噬成熟及增加MPP^+处理的PC12细胞活存

目的观察IL-6在1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导PC12细胞自噬性细胞死亡中的作用。方法通过对MPP+处理的PC12细胞进行IL-6干预,MTT法观察细胞增殖,Western blot观察LC3-Ⅱ变化,电镜观察自噬体含量。结果 MPP+处理的PC12细胞自噬水平明显上升,巴佛洛霉素处理后,自噬水平轻度上升;IL-6处理的PC12细胞自噬水平由0.125±0.021升至0.358±0.038(P<0.01),但不如MPP+处理组明显,巴佛洛霉素处理后,自噬水平上升明显。IL-6可以降低MPP+处理的PC12细胞的自噬水平,增加细胞的增殖能力。结论 IL-6可以通过促进自噬成熟,减少MPP+诱导的细胞损伤,促进PC12细胞的活存。

防己诺林碱阻断自噬抑制H1N1病毒感染的研究

目的探索防己诺林碱在细胞水平抗H1N1病毒的作用,阐明防己诺林碱调控细胞自噬抑制H1N1病毒复制的分子机制。方法CCK-8法检测0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000、20.0000、40.0000、60.0000μmol·L^(−1)的防己诺林碱对MDCK细胞活力的影响;MDCK细胞设置对照组、模型组和防己诺林碱(2.5、5.0、10.0μmol·L^(−1))组,除对照组外,以感染复数(MOI)为0.1的H1N1病毒感染MDCK细胞,加入防己诺林碱共同孵育12 h,同时设置防己诺林碱(10.0μmol·L^(−1))与病毒共同孵育4、8 h组,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR,检测HIN1 mRNA表达)和Western blotting[H1N1病毒核蛋白(NP)]检测防己诺林碱对病毒复制的抑制作用;PI/Hoechst 33342染色检测防己诺林碱(10.0μmol·L^(−1))对MDCK细胞死亡的影响;qRT-PCR法检测防己诺林碱检测防己诺林碱预处理、病毒感染早期药物处理、病毒感染晚期药物处理以及吸附和进入阶段给药对病毒复制的影响;MDCK细胞转染EGFP-LC3或EGFP-mCherry-LC3双荧光质粒,观察防己诺林碱对EGFP-LC3的荧光强度、EGFP-mCherry-LC3共定位的影响,设置自噬诱导剂雷帕霉素(0.5μmol·L^(−1))、自噬晚期抑制剂氯喹(10μmol·L^(−1))、巴佛洛霉素A1(100 nmol·L^(−1))对照。转染过EGFP-LC3质粒的MDCK细胞感染H1N1病毒,免疫荧光检测防己诺林碱对LC3与胞内的病毒NP蛋白共定位的影响;体外培养A549细胞,以MOI为0.1的H1N1病毒感染,Western blotting检测防己诺林碱对LC3II/LC3I蛋白表达的影响。结果防己诺林碱对MDCK细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为40.19μmol·L^(−1);与模型组比较,防己诺林碱以浓度相关性的方式抑制HIN1 mRNA表达,以浓度和时间相关性的方式抑制NP蛋白表达(P<0.01、0.001);显著减少H1N1诱导的细胞死亡(P<0.001);抑制H1N1病毒进入过程。与对照组比较,防己诺林碱处理诱导LC3荧光聚集,诱导EGFP-LC3和mCherry-LC3双荧光共定位显著增加(P<0.001)。与模型组比较,防己诺林碱处理明显减少NP的荧光数量(P<0.001),同时造成LC3荧光积累并与胞内的病毒NP蛋白共定位;引起LC3II积累(P<0.01、0.001)。结论防己诺林碱同氯喹和巴佛洛霉素A1一致,阻断自噬途径,使病毒粒子在自噬体内滞留,破坏病毒生命周期。

溶酶体酸性环境促进猪血凝性脑脊髓炎病毒的复制

为解析猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)复制和溶酶体酸性环境的相关性,本研究以PHEV感染神经瘤母细胞(N2a细胞)为模型,利用Western blot和间接免疫荧光方法进行检测,发现PHEV感染神经细胞后溶酶体关联膜蛋白1(LAMP1)表达显著升高,病毒能与溶酶体共定位,并使溶酶体体积增大。其次,用溶酶体荧光探针Lyso Tracker Red DND-99标记活细胞溶酶体,结果发现病毒感染神经细胞后溶酶体的酸性增强。再者,用巴佛洛霉素A1(BafA1)阻止神经细胞溶酶体酸化后接种病毒,发现与未处理的细胞感染组相比,胞内病毒含量显著降低,表明抑制溶酶体酸化能够阻碍细胞内子代病毒的产生。本研究结果表明PHEV感染神经细胞后能定位于溶酶体,影响溶酶体的酸性环境,并且揭示了子代病毒的产生依赖溶酶体的酸性环境;研究结果为深入解析溶酶体与PHEV复制的相关性提供了依据。