利用响应面法优化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件

10-脱乙酰基巴卡亭III(10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物多烯紫杉醇的前体物质。采用响应面法优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件。利用Box-Behnken试验和方差分析,从菌体培养时间、菌体浓度OD600、底物终浓度、转化温度、转化时间5个方面优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件。结果表明,获得最佳转化工艺条件为:菌体经过二级培养12 h,转接后调节初始OD600为3.0,此时,加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液,使其终浓度为0.007 mg/m L,32℃,200 r/min下转化4 d,此时10-DAB的生成率达到24.5%,比优化前提高了446.8%。实验结果表明,响应面法优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件合理可行。该研究成果对于多烯紫杉醇生物合成具有重要的应用价值。

苯丙氨酸、蔗糖和甘露醇对杂种红豆杉细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭III和10-去乙酰基巴卡亭III的影响

研究了苯丙氨酸、蔗糖和甘露醇对杂种红豆杉悬浮细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭ＩＩ和１０去乙酰基巴卡亭ＩＩ的影响。结果表明，培养基中添加１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１或２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１苯丙氨酸和在培养２８ｄ时同时补加７３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖和１３７３ｍｍｏｌ·Ｌ－１甘露醇能显著地促进细胞的生长和这３种紫杉烷的形成。同对照相比，有苯丙氨酸又补加蔗糖和甘露醇的细胞生物量增加了０６～０８倍，紫杉醇的产量增加了９～１０倍，巴卡亭ＩＩ的产量增加了２５～３０倍，１０去乙酰基巴卡亭ＩＩ的产量增加了７倍。在培养２８ｄ时补加７３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖能显著地促进细胞的生长，但对细胞中这３种紫杉烷的含量没有显著的影响。

红豆杉内生真菌中巴卡亭Ⅲ产生菌的筛选及培养基的初步优化

目的:筛选出产巴卡亭Ⅲ的红豆杉内生真菌,为抗癌药物紫杉醇提供一个新的来源。方法:从云南红豆杉树皮中分离纯化出内生真菌,对其进行液体发酵培养,过滤,收集菌丝体并破碎,用二氯甲烷萃取,萃取液进行薄层层析,与巴卡亭Ⅲ标准品有相同比移值的样品再利用高效液型色谱与标样进行比照,进而筛选出产巴卡亭Ⅲ的内生真菌。同时以发酵培养基基础,对筛选出的真菌进行碳源和氮源的优化。并在此基础上探讨几种常见的紫杉烷类化合物代谢诱导剂乙酸钠、苯甲酸钠、苯丙氨酸和亮氨酸的浓度对巴卡亭Ⅲ积累的影响。结果:得到一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌NSZJ043,该菌株易培养,生长迅速,经鉴定属于曲霉属。NsZJ043产巴卡亭Ⅲ的培养条件的初步优化结果表明:最适碳源、氮源分别是蔗糖和蛋白胨;在含20g/L蔗糖、1．5g/L蛋白胨、0．1 mmol/L乙酸钠、0．01mmol/L苯甲酸钠的优化培养基中培养8d,巴卡亭Ⅲ含量为34．6μg/L。结论:筛选出一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌,其具有优良的发酵特性,巴卡亭Ⅲ前体物质苯甲酸钠和乙酸钠对巴卡亭Ⅲ的合成有促进作用;苯丙氨酸和亮氨酸对其含量影响不显著,优化后NSZJ043产巴卡亭Ⅲ含量有较大的提高。

HPLC法测定东北红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭的含量

目的 测定东北红豆杉枝叶中 10 -脱乙酰巴卡亭 (10 - deacetylbaccatin ,10 - DAB )的含量。方法 采用 RP- HPL C法。 C1 8色谱柱 (2 5 0 mm× 4 .6 mm ,5μm) ,甲醇 -乙腈 -水 (2 0∶ 30∶ 5 0 )作为流动相 ,检测波长为 2 33.9nm。结果 10 - DAB 在 0 .0 0 4 75～ 0 .0 38μg与峰面积线性关系良好 (r=0 .9990 ) ,平均回收率为 10 0 .5 % ,RSD为 2 .0 %。结论 方法操作简便、灵敏度高、专属性强 ,可用于红豆枝叶中 10 - DAB 的质量控制。

一株产巴卡亭Ⅲ红豆杉内生真菌的分离与鉴定

[目的]分离鉴定产巴卡亭Ⅲ红豆杉内生真菌。[方法]采用常规分离方法,从东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb.etZucc.)树皮中分离并筛选内生真菌35株;通过高效液相色谱(HPLC)技术对菌株发酵物进行检测,并结合选择性离子质谱(MS)进行确认,从中获得1株能产紫杉醇前体物质巴卡亭Ⅲ的菌株Z-1;利用ITSrDNA通用引物对产紫杉烷类物质的内生真菌进行分子生物学鉴定,并结合菌落特征、孢子与分生孢子梗的形态特征进行分类鉴定。[结果]在未经诱导的情况下,Z-1产巴卡亭Ⅲ的量约为39μg/L;形态和分子鉴定分析判定Z-1属于木霉属(Trichoderma sp.)真菌。[结论]该研究可为植物内生真菌产紫杉烷类化合物的种类多样性和产紫杉烷类内生真菌的生物多样性提供依据。

多西紫杉醇合成原料10-脱乙酰基巴卡亭提取工艺研究

以欧洲紫杉(Taxus Daecata)枝叶为原料,提取并分离活性成分10-脱乙酰基巴卡亭(10-DAB)。通过对提取溶剂和提取条件的筛选,得出以丙酮/乙酸乙酯混合溶剂在65℃回流提取为最佳提取条件。改进了传统以二氯甲烷/水萃取条件,而以二氯甲烷/20%乙醇2%氢氧化钠水溶液萃取,降低了乳化提高了产品含量和收率。利用柱层析色谱技术及重结晶技术等现代分离技术分离并纯化了10-DAB,并通过HPLC进行含量测定,最后得到含量96.8%、总收率为67.2%的10-DAB。

反相高效液相色谱法测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的研究

目的:建立测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的反相高效液相色潜法。方法:采用硅胶层析柱(BUCHI,Φ12mm×75 mm,40～63μm),以甲醇-水(1:1)为洗脱剂对曼地亚红豆杉提取液进行初步分离制备供试品溶液;HPLC 检测条件:SHIM—PACK VP—ODS 色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-水(45:55)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为40℃,检测波长为232 nm。结果:10-DABⅢ浓度在0.04～4.00μg·mL^(-1)范围(r=0.9974),与峰面积呈良好线性关系(n=6);回收率(n=9)为99.5%～104.9%,RSD 为1.0%～1.8%。结论:曼地亚红豆杉提取液用硅胶柱层析后,多数高含量非目标物被分离,消除了高含量非目标物对10—DABⅢ测定的影响,HPLC 检测条件简单,获得满意的效果。

东北红豆杉枝叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭的分离纯化及检测

目的用HPLC法对东北红豆杉枝叶中的紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭(10-DAB)进行分离、纯化并对其进行检测。方法采用提取的办法从红豆杉枝叶中粗提紫杉醇和10-DAB;用硅胶色谱柱对粗提物进行分离纯化并进行重结晶;用HPLC法对纯化物进行检测。结果建立了HPLC法,对紫杉醇和10-DAB进行分离、纯化及检测。结论方法简便、准确度高、重现性好。

南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的分离与纯化

目的:以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其中活性成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的分离和纯化条件,并进行优化筛选。方法:综合运用浸提、萃取(包括液液萃取和反萃取)、色谱分离和重结晶技术得到10- DABⅢ晶体,并采用UV,HPLC法进行分析鉴定。结果:得到了用以合成高效抗癌药紫杉醇的前体——10-DABⅢ晶体,纯度可达91%,整个工艺收率达7．9%。结论:本实验为首次采用该工艺路线得到10-DABⅢ和紫杉醇,总收率达60%以上,可用于进一步的工业化研究。

云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色谱法测定

目的建立以固相萃取-高效液相色谱（HPLC）法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。方法固相萃取柱：Agilent ODS C18500 mg/3 ml;色谱柱：Agilent zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相：甲醇-水-乙腈（35∶55∶10）,流速1.0 ml.min^-1,检测波长227 nm,柱温30℃。结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在1.6-8.0μg.ml^-1范围内,进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为96.8%,RSD为4.8%（n=6）。结论该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定,方法稳定,结果准确、可靠。

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。

南方红豆杉菌根菌液体纯发酵培养产紫杉醇及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

从南方红豆杉菌根菌中筛选出产紫杉醇和紫杉烷类化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的高产菌株,对分离获得的21株菌株进行了液体发酵培养实验,通过TLC、HPLC及LC-MS检测发现,有10株菌株具有产紫杉醇及紫杉烷类化合物的能力,其中4株菌株中产10-DAB分别为260.05、92.88、393.27、70.52μg/L,但未检出产紫杉醇;6株中产紫杉醇分别为434.94、1 242.19、200.65、360.77、317.90、29.82μg/L,但未检出产10-DAB,说明南方红豆杉的各种菌根真菌虽具有合成紫杉醇或紫杉烷类化合物的能力,但各自所合成化合物有差异,不同种类的菌根菌可能分别参与了紫杉醇生物合成的不同环节,即南方红豆杉菌根高含量紫杉醇的生物合成可能是多种菌根菌协同参与作用的结果,且其中的高产菌株具有发酵生产紫杉醇的潜力。

云南红豆杉生长过程中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量变化

目的研究云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetyl baccatinⅢ）的含量变化。方法采用色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为甲醇-乙腈-水（42∶13∶45）,流速1.0 m l.min^-1,柱温32℃,检测波长234 nm,测定云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。结果回归方程Y=15.290 29X-4.059 76（r=0.999 0）,线性范围5.50～550μg.ml^-1;加样回收率（n=6）98.6%,RSD为2.4%。在云南红豆杉生长期树皮中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量高于枝叶,是枝叶中最高含量的1.498倍;休眠芽分化期和休眠期是10-去乙酰巴卡亭Ⅲ积累的关键时期,在枝叶中的含量显著高于树皮,最高含量达0.115 0%是树皮中最高含量的1.769倍,二年生枝叶中含量略高于一年生枝叶。结论该方法简便、准确度高,可用于云南红豆杉枝叶的质量控制。

高效液相色谱法测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的:建立云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭III含量的测定方法。方法:样品经干燥研细后采用甲醇浸提、乙酸乙酯萃取,测定同一批细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭III含量,采用Spherisorb C185μm柱,流动相甲醇-乙腈-水(42∶13∶45),流速1.0ml/min,检测波长为234nm。结果:云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量为0.023 47%,平均回收率为100.6%,变异系数(RSD)为2.2%。结论:该方法能准确、快速测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量,为探讨10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在细胞培养物中的代谢研究提供测定方法。

HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的 本实验采用RP-HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deaxetylbaccatin Ⅲ）的含量。方法 利用C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）甲醇-乙腈-水（5：35：60）作为流动相，检测波长为227nm。结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在0．096～1．947μg与峰面积线性关系良好，Y=1351．973X＋1．903（R^2=0．999），平均回收率为95．90％，RSD为1．94％。结论 此方法可靠简便、重现性好、灵敏度高，具有很高的实用价值，而且未见报导，可用于红豆杉植物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的定性、定量分析。

一种由白色类诺卡放线菌产生的新的巴卡亭ⅢC—10脱乙酰酶

紫杉醇及多烯紫杉醇是目前临床上最重要的抗癌药物，而10-DAB是半合成紫杉醇及多烯紫杉醇的前体。通过TLC监测及HPLC-MS证实，发现了一种由白色类诺卡氏菌产生的、新的巴卡亭ⅢC-10脱乙酰酶，该酶能催化巴卡亭Ⅲ生成10-DAB，酶的最适pH值和对甲醇的耐受性方面不同于已报道的巴卡亭ⅢC-10脱乙酰酶，它具有更强的底物专一性和更强的耐甲醇能力，酶的Km值为1．52mmol／L，Vmax为2．59×10^-7mmol／L·s。

巴卡亭Ⅲ对心房纤维化的作用及其机制研究

为探讨巴卡亭Ⅲ对心衰诱导的心房纤维化是否有效及潜在作用机制,本研究对C57BL/6小鼠行胸主动脉缩窄手术,构建心衰模型,进一步腹腔注射巴卡亭Ⅲ,以观察心房纤维化程度及相应信号通路的改变.在体外使用血管紧张素Ⅱ刺激成年小鼠心房成纤维细胞,巴卡亭Ⅲ处理后观察心房成纤维细胞分化、迁移和分泌细胞外基质的能力及TGF-β1/Smad2/3信号通路的改变.临床样本表明,心衰可以加重心房纤维化的程度(P<0.05).动物实验表明,巴卡亭Ⅲ可以减轻心衰诱导的小鼠心功能不全及左心房扩大和纤维化,并减轻心房组织TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活(P<0.01).细胞实验表明,巴卡亭Ⅲ可以抑制Ang-Ⅱ所诱导的心房成纤维细胞分化、迁移和分泌细胞外基质的能力和减轻心房成纤维细胞TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活(P<0.01).表明巴卡亭Ⅲ可通过TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制心房成纤维细胞的活动,从而减轻心衰诱导的心房纤维化的发生发展.

南方红豆杉与引种德国曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的比较

目的：建立HPLC法同时测定并比较南方红豆杉与德国引种曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量。方法采用CosmasilTMC18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）；以乙腈-水（50∶50）为流动相；流速为1．0mL·min-1；检测波长为227nm；柱温：30℃。结果紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的线性范围分别为2．675～42．8μg·mL-1（r＝0．9993）和3．875～62μg·mL-1（r＝0．9996），平均加样回收率（n＝9）分别为98．1％和101．6％，RSD分别为2．7％和2．3％。南方红豆杉与德国引种曼地亚红豆杉的茎、叶中紫杉醇含量分别为0．12和0．10mg·g^-1，10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别为0．12和0．14mg·g^-1。结论引种红豆杉与南方红豆杉在同一地区的生态环境下生长，茎、叶中所含紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量有显著性差异（P＜0．05）。所建立方法准确，简便，适用于红豆杉的质量评价，为不同栽培品种的选择提供参考。

红豆杉活性成分巴卡亭Ⅲ对大鼠肺纤维化的干预作用

目的:观察红豆杉活性成分巴卡亭Ⅲ对实验性大鼠肺纤维化的干预作用。方法:大鼠随机分为空白组、模型组、强的松组和巴卡亭Ⅲ组,通过气管内注射博莱霉素(BLM)复制肺纤维化模型,于造模后第2天治疗组开始给药,给药后第14天处死大鼠,取肺组织,行HE染色,并行免疫组化细胞外信号调节酶(ERK1)测定。结果:巴卡亭Ⅲ能减轻大鼠肺泡炎症及肺纤维化程度(P<0.01),并能减少ERK1的表达。结论:巴卡亭Ⅲ对BLM诱导产生的大鼠肺纤维化有一定的干预作用。

不同扶正方对红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影响

目的：建立红豆杉水煎液中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10．DABⅢ）HPLC分析方法，观察不同扶正方（养阴代表方、益气代表方、温阳代表方）对红豆杉中10．DABⅢ煎出量的影响。方法：采用反相高效液相色谱法，c18色谱柱（4．61mm×250mm，5μgm），流动相为甲醇：水（40：60），流速为1mL／min，检测波长为：227Bin，柱温为25℃。结果：10-DABⅢ在20～400μg／mL范围内峰面积与含量成线性关系（Y=6．5015X4-20．792，r=0．99997），平均回收率为103．86％（RSD=1．83％）。红豆杉组、红豆杉配伍养阴代表方组、红豆杉配伍益气代表方组、红豆杉配伍温阳代表方组中10-DABⅢ的含量依次为（2．004±0．091）、（2．286±0．0734）、（2．096±0．097）、（1．640±0．138）mg（n=3）。结论：不同扶正方对红豆杉中10．DABⅢ煎出量存在明显差异，可为红豆杉临床合理使用提供参考实验依据。