巴夫杜氏藻1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因的克隆和分析

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中的一个关键酶,其小亚基rbcS具有调控羧化反应催化效率和影响该酶对二氧化碳/氧气底物特异性的功能。从巴夫杜氏藻中克隆rbcS基因及其5′-上游序列,并对基因及5′-上游序列进行了分析。根据已知rbcS基因保守核苷酸序列设计引物,分别克隆到1 841 bp的DNA和380 bp的cDNA序列。以此为基础,使用染色体步移(Genome walking)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,获得了799bp的5′端DNA序列和500 bp的3′端cDNA序列。序列分析发现,巴夫杜氏藻rbcS DNA全长为2 031 bp(不包括476 bp 5′-上游序列),cDNA全长包括570 bp开放读码框(GenBank登录号:HQ315783)和294 bp 3′端非翻译区。5′-上游序列区域存在一系列预测的顺式作用元件。该研究旨在为后继的rbcS基因的功能和表达研究、Rubisco的遗传改造奠定基础。同时,rbcS启动子因其可驱动基因高效表达而引起广泛关注,因此获得的rbcS 5′-上游序列经验证和优化后,可用于在嗜盐微藻中驱动转基因的高效表达以及完善微藻转化系统。

巴夫杜氏藻GAPDH基因部分序列的克隆

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的一个关键酶,由于其基因表达量相对恒定,因此在定量和半定量PCR试验中常被用作内源参照基因来确定目标基因的相对表达量。从巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)中克隆GAPDH基因,并对基因序列进行了分析。以巴夫杜氏藻cDNA为模板,根据GAPDH的保守序列设计引物,PCR扩增获得了673 bp的cDNA序列。在此基础上,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,获得了913 bp的3′-cDNA序列,进而获得了cDNA部分序列1 393 bp。序列分析结果表明:巴夫杜氏藻GAPDH cDNA部分序列包括1 055 bp的编码区和338 bp的3′非翻译区。该基因的克隆为半定量和定量PCR等技术在巴夫杜氏藻分子生物学研究中的应用提供了内源参照基因。

培养基成分含量对巴夫杜氏藻生长的影响

通过固定培养基中其它成分的含量,考察变化的成分含量对巴夫杜氏藻生长的影响,以期获得适宜生长的最佳单一养分浓度。结果表明,硝酸钠和氯化钠在实验浓度范围内(0.042 g/L^1.68 g/L和14.615 g/L^175.38 g/L)对巴夫杜氏藻的生长有显著影响,碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸铁、A5溶液和pH值对藻生长影响较小。可以通过调控硝酸钠和氯化钠的浓度来促进巴夫杜氏藻的生长。

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5'-Genome Walking和3'-RACE的方法,获得基因的5'-端DNA序列和3'-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5'-端DNA和3'-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1754bp,包括1137bp的开放读码框和617bp的3'-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。

巴夫杜氏藻不同生长时期的转录组分析

巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)是一类独特的耐盐绿藻,富含多种生物活性物质,具有宝贵的工业应用价值。随着转录组测序技术的广泛应用,越来越多的藻类功能基因被发掘。然而,巴夫杜氏藻在不同生长时期的转录组测序仍见未报道,这极大限制了该藻株生长发育机制的深入研究。该研究综合运用形态学、组学及生物信息学技术,对生长初期、中期和末期的巴夫杜氏藻进行转录组测序分析。结果显示,9个cDNA测序文库共获得90153条UniGenes,其中coding domain sequences 49643条,66.36%可被七大生物数据库注释,de novo组装了272条Contigs,其中N_(50)为1305 bp,GC百分比52.32%。基于基因的差异表达值可将UniGene划分为4簇,以生长初期实验组为对照,筛选获得下调基因数(52891条)高于上调基因数(33496条),共有基因数20759条。生长中期与初期及生长末期与初期间的基因本体论富集程度最高的均是细胞膜的整体成分,生长中期与初期及生长末期与初期间的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集程度最高的分别是剪接体和RNA转运。该研究获得的巴夫杜氏藻转录组测序数据及组装质量较高,筛选的差异表达基因及预测的功能信息可为该藻生长发育调控机制的研究、资源品质的分子改良及工业应用奠定基础。

乙酸对两种杜氏藻生长和细胞生化组成的影响

研究了乙酸对两种杜氏藻(Dunaliella salina和D.parva)生长、β-胡萝卜、素积累、叶绿素a合成、脂肪酸组成和蛋白质含量的影响。结果表明,对D.salina,乙酸可明显促进生长。细胞密度最大值120×104cell/mL(pH≤8.5),β-胡萝卜素最大值102mg/g(pH≤8.0),叶绿素a含量达到104 mg/g(ph≤8.5),与对照组相比均有显著差异;乙酸还可提高单不饱和脂肪酸18. 1和多不饱和脂肪酸18:2n6的含量;蛋白含量随pH升高而提高。对D.parva,乙酸对生长无明显促进作用,也不能提高β-胡萝卜素含量,但明显提高叶绿素a含量,最大值达144 mg/g (pH≤9.0),还可提高蛋白含量,达到33.5%(ph≤9.0)。

巴夫杜氏藻rbcS基因启动子的克隆及序列分析

根据已经获得的巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit gene,rbcS)的部分启动子序列设计三条特异引物,用于扩增延伸的启动子序列。采用Genome Walking方法,以总DNA为模板克隆了巴夫杜氏藻rbcS基因的延伸启动子序列1466 bp,启动子总长1582 bp。通过PlantCARE分析1582 bp序列,检测出启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box。另外,还包括多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素响应元件、低温诱导元件等。值得注意的是,在启动子中发现了两个可以提供高转录水平的元件5UTR Py-rich stretch。该序列的克隆与分析为进一步研究巴夫杜氏藻rbcS的表达调控提供数据依据。