小分子前体物对巴弗洛霉素A1生物合成的影响

通过研究小分子前体物对巴弗洛霉素A1 生物合成的影响,寻找提高巴弗洛霉素A1 发酵产量的有效方法。主要考察了不同前体物对巴弗洛霉素A1 生物合成的影响,以及有效前体物的最佳添加浓度和添加时间点。结果显示,缬氨酸是巴弗洛霉素A1 合成的最佳前体,36 h 时添加0.2%缬氨酸,巴弗洛霉素A1 产量高达285.5 mg/L,比对照组提高了78.4%。前体物的供给能显著影响巴弗洛霉素A1 的生物合成,补加缬氨酸能有效提高巴弗洛霉素A1 的发酵产量。

巴弗洛霉素A1抑制胃癌MGC-803细胞增殖及增强奥沙利铂的敏感性

目的探讨巴弗洛霉素A1对抑制胃癌细胞自噬、增殖、侵袭、凋亡和奥沙利铂敏感性的影响。方法将胃癌MGC-803细胞分为空白对照组(Control组)、巴弗洛霉素A1组(BAF组)、奥沙利铂组(OXA组)及巴弗洛霉素A1+奥沙利铂(O+B组)。分别采用MTT法、平板克隆形成实验检测细胞增殖活力;Elisa法检测细胞核小体表达水平;Transwell法检测细胞运动能力;扫描电镜、免疫组化及Western blot检测自噬水平;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达情况。结果 BAF组与Control组相比自噬水平显著降低,BAF组增殖活力、迁移细胞数及侵袭细胞数显著低于Control组(P=0.000),核小体和Bax表达显著高于Control组(P=0.000),Bcl-2表达低于Control组(P=0.046)。O+B组与OXA组相比自噬水平显著降低,此时O+B组细胞增殖活力、迁移细胞数及侵袭细胞数显著低于OXA组(P=0.000),凋亡率显著高于OXA组(P=0.000),Bcl-2相对表达量显著低于OXA组(P=0.001),Bax相对表达量显著高于OXA组(P=0.000)。结论巴弗洛霉素A1通过抑制自噬能够显著抑制胃癌MGC-803细胞的增殖和运动能力,促进凋亡,而且能增强奥沙利铂的药物敏感性。

巴弗洛霉素A1抑制前列腺癌转移的初步探讨

目的通过检测前列腺癌细胞中质子泵V-ATPase酶的相关基因和相关蛋白的表达,探讨V-ATPase酶抑制剂巴弗洛霉素A1在治疗前列腺癌转移中的潜在价值。方法检测前列腺癌细胞系PC3细胞中质子泵V-ATPase酶相关基因和相关蛋白表达水平;在此基础上,使用巴弗洛霉素A1刺激PC3细胞,观察前列腺癌细胞增殖、迁移和细胞内酸化等生物学行为变化。结果质子泵V-ATPase酶V-ATPaseV1A1、V-ATPase V1E和V-ATPase V0A1亚单位在PC3细胞内表达高于人骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞组,差异均有统计学意义(t分别=-13.78、-19.33、-13.45,P均<0.05)。利用V-ATPase酶抑制剂巴弗洛霉素A1(10 nmol)处理96 h,仅有12.00±3.00%的前列腺癌细胞增殖,差异有统计学意义(t=37.17,P<0.05)。与此同时,利用2.5 nmol巴弗洛霉素A1处理时,发生迁移的前列腺癌细胞数量从对照组的(233.33±20.55)个/孔,下降为(105.00±7.02)个/孔迁移,差异有统计学意义(t=8.07,P<0.05)。进一步分子生物学机制分析表明,2.5 nmol巴弗洛霉素A1可完全抑制V-ATPase介导的酸化。结论应用巴弗洛霉素A1可使前列腺癌细胞酸化受影响,从而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移功能。

巴弗洛霉素A1对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及自噬的抑制作用

目的探讨巴弗洛霉素A1(Baf-A1)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法采用终浓度为0.1、0.5μmol/L的Baf-A1处理Tca8113细胞,并设不加药的对照组。MTT比色法测定对照组及不同浓度Baf-A1处理0、24、48、72 h细胞的增殖情况,流式细胞仪检测0.5μmol/L Baf-A1处理72 h的细胞周期,Western blotting、细胞免疫荧光检测自噬标记蛋白LC3B的表达,电子透射显微镜观察细胞自噬体形成情况。结果 Baf-A1呈剂量依赖性抑制Tca8113细胞增殖,0.5μmol/L Baf-A1处理72 h时细胞增殖抑制作用最明显。流式细胞仪检测显示,与对照组比较,Baf-A1组sub-G1期、G1期细胞增多(P<0.05),S期和G2/M期细胞减少(P<0.05)。Baf-A1组LC3B-II蛋白的相对表达量为1.83±0.23,高于对照组的0.79±0.18(P<0.01);细胞免疫荧光检测显示,对照组中可见少量LC3B表达,而Baf-A1组72 h后可见大量LC3B点状聚集物;电镜观察显示,与对照组比较,0.5μmol/L Baf-A1处理后可见大量自噬体形成,自噬溶酶体形成增加。结论 Baf-A1对舌鳞癌Tca8113细胞有增殖抑制作用,可能与其阻滞细胞周期和抑制细胞自噬有关。

V-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素A1对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响

目的探讨V-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf-A1)对食管鳞癌(ESCC)细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响。方法通过CCK-8法检测ESCC细胞Eca109和KYSE150经Baf-A1处理后的细胞活力并计算20%抑制浓度(IC 20)和50%抑制浓度(IC 50),采用BCECF-AM探针检测IC 20浓度的Baf-A1处理后的细胞质pH水平,IC 20浓度的Baf-A1联合8 Gy辐射剂量处理后行流式细胞术和γ-H2AX共聚焦显像实验观察Baf-A1对ESCC细胞凋亡的影响,基于克隆形成实验观察Baf-A1对ESCC细胞放射敏感性的影响,Western blotting和实时定量PCR检测ESCC细胞增殖和凋亡相关因子的水平。结果Eca109和KYSE150细胞经Baf-A1(0、1、10、100、1000 nmol/L)处理后的细胞活力均呈浓度依赖的方式下降,对应IC 50分别为163.4和175.3 nmol/L;经Baf-A1(0、5、10、20、40、80、160 nmol/L)处理48 h后的IC 20约为60 nmol/L。Baf-A1处理ESCC细胞48 h后的ATP6V0C水平降低且细胞内BCECF绿色荧光减弱。8 Gy照射后,Baf-A1处理ESCC细胞的凋亡率升高,γ-H2AX信号延长且凋亡抑制因子Bcl-2和DNA损伤修复因子PARP水平降低而促凋亡因子Bax水平升高,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。单击多靶模型拟合曲线显示,Baf-A1处理的Eca109和KYSE150细胞与对应对照细胞相比,增敏比分别为1.23和1.29。结论通过V-ATP酶抑制剂Baf-A1改变肿瘤细胞的酸环境可提高ESCC细胞的放射敏感性,这为ESCC的治疗提供了潜在策略。

自噬水平改变对胃癌SGC-7901细胞侵袭转移能力的影响

目的探讨改变胃癌细胞自噬水平对其侵袭转移能力的影响。方法将胃癌SGC-7901细胞分为空白对照组(CON组)、乏氧组(HPX组)及乏氧联合巴弗洛霉素A1(BAF-A1)组(H+B组)。分别采取吖啶橙染色及Western blot检测胃癌细胞自噬水平;Transwell法检测细胞侵袭转移能力;Western blot检测侵袭转移相关蛋白表达情况。结果与CON组相比,HPX组红色荧光量显著增多,Beclin1相对表达量显著增高(P=0.000),侵袭转移细胞数显著增多(P=0.001),E-Cadherin蛋白相对表达量显著降低(P=0.021),MMP-9蛋白相对表达量显著增高(P=0.013);与HPX组相比,H+B组红色荧光量显著减少,Beclin1相对表达量显著降低(P=0.000),侵袭转移细胞数显著减少(P=0.000),ECadherin蛋白相对表达量显著增高(P=0.001),MMP-9蛋白相对表达量显著降低(P=0.001)。结论乏氧状态提高胃癌细胞自噬水平后其侵袭转移能力显著增强,而当其自噬水平被BAF-A1抑制后胃癌细胞的侵袭转移能力显著降低。

抗玉米病原真菌的内生放线菌PC-F1的分离及活性物质鉴定

放线菌是一类具有分支状菌丝形态的细胞,革兰氏呈阳性,与人类的生产、生活密切相关,被医药行业广泛应用的抗生素,其中70%都是从放线菌的代谢产物中获得。近年来,从新分离环境中获得稀有放线菌,并研究其活性代谢产物逐渐成为热点。本试验以从农业生境中采集的昆虫为研究对象,对其稀有放线菌进行筛选。结果表明:分离得到一株活性较好的内生放线菌PC-F1,并对其活性成分进行鉴定,初步判断是一种巴弗洛霉素系列化合物-巴弗洛霉素B1。

巴弗洛霉素A1抑制卵巢癌细胞SKOV3自噬并增强化疗敏感性的作用机制

目的:研究巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)对5-氟尿嘧啶(5-FU)作用下的卵巢癌细胞SKOV3自噬的抑制作用及其增强化疗敏感性的可能机制。方法:将SKOV3细胞随机分为3组,A组:50μmol/L5-氟尿嘧啶(5-FU)处理48h;B组:100nmol/L巴弗洛霉素A1给药1h后加入50μmol/L5-FU处理48 h;C组(阴性对照):不作任何处理。3组细胞均应用吖啶橙染色、间接免疫荧光技术检测卵巢癌细胞SKOV3自噬形态学变化;并通过Western blotting检测巴弗洛霉素A1对SKOV3细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)及自噬相关蛋白Beclin1表达的影响。结果:B组产生的红色酸性区域明显减少,LC3定位的荧光亮度减弱,细胞内LC3、Beclin1蛋白表达量显著降低。结论:巴弗洛霉素A1可能通过减少SKOV3细胞酸性区域的数量,抑制LC3产生从而抑制SKOV3细胞的自噬。

大鼠大脑皮质神经细胞氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后自噬对凋亡的抑制作用

目的 观察大脑皮质神经元氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后自噬对凋亡的影响。方法 取18只出生在24 h内的新生SD大鼠,采用机械分离胰蛋白酶消化法提取大脑皮质神经元培养7 d后,建立OGD/R模型,随机分为3组,正常对照组、OGD/R组、OGD/R联合巴弗洛霉素A1(BafA1)组。采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测细胞活力,用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,采用反转录PCR法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62及胱天蛋白酶3(caspase-3)的mRNA表达,Western blot法检测LC3、 P62及caspase-3的蛋白表达。采用红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-LC3(RFP-GFP-LC3)腺病毒转染神经细胞检测自噬荧光强度,透射电子显微镜观察自噬体的超微结构变化。结果 与对照组相比,OGD/R组神经细胞活力明显降低,LDH释放水平明显升高,凋亡增加;LC3、 P62、 caspase-3的mRNA和蛋白表达增强;RFP荧光强度增加,自噬体增加且自噬溶酶体更加聚集,加用自噬晚期抑制剂BafA1后RFP荧光强度显著降低。结论 OGD/R诱导了神经元细胞的自噬和凋亡,抑制自噬后加重了神经细胞的损伤和凋亡。

细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤

目的在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用。方法出生24 h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7 d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24 h复糖复氧等6组,每组n=6;免疫印迹(Western blot)法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值;借助MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,检测神经元的损伤;用细胞自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf A1100 nmol/L)抑制自噬后,观察神经元的损伤。结果与对照组相比,随OGD时间的延长,自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,30 min达到峰值,之后略有回降(P<0.05);在OGD处理30和60 min致使神经元显著损伤的基础上,细胞自噬抑制剂Baf A1可明显加重60 min OGD处理神经元的损伤和提高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P<0.05)。结论 OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生,且细胞自噬可缓解OGD处理皮质神经元的缺血损伤。

产体外抗鼻咽癌物质红树林土壤细菌筛选及其活性成分分析

研究一株通过活性筛选获得的、具有抗鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)活性物质生产潜力的细菌,对其所产活性物质进行分离纯化,以探讨其抗肿瘤研发价值。以鼻咽癌肿瘤细胞株TW03和5-8F作为测试对象,利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)法从广西北海采集的红树林土壤中筛选出具有体外抗鼻咽癌活性物质生产潜力的细菌,通过基因分析、细菌形态以及生理生化特性对活性菌株进行分类鉴定,通过柱层析分离和活性测试追踪法从菌株的发酵液中获得具有体外抗鼻咽癌活性的化合物,并应用核磁共振波谱和低分辨质谱鉴定其结构。结果表明,经16S rRNA和看家基因(atpD和rpoB)的多位点序列分析鉴定菌株归属于链霉菌,命名为Streptomyces sp.MCCG 218。从该菌株的发酵液中分离得到一个活性化合物1,经图谱分析和文献比对确认该化合物为巴弗洛霉素A1衍生物(17,18-dehydro-24-demethyl-bafilomycin A1),其对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F表现出较强的细胞增殖抑制活性,半抑制浓度(Half Inhibitory Concentration,IC_(50))值分别为2.7μmol/L和9.2μmol/L。红树林来源链霉菌MCCG 218能够生产具有抑制鼻咽癌细胞增殖活性的化合物巴弗洛霉素A1衍生物。