人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P .pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)。设计引物从pGEM HBscFv上扩增目的基因 ,亚克隆至P .pastoris表达载体pPICZαA中 ,线性化后转化P .pastorisGS115 ;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后 ,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现 ,重组HBscFv可以在α因子的引导下 ,分泌至培养基中 ,产量为80mg L ;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性 ,活性总量在诱导培养 72h后达最高峰 ,在诱导培养后期 ,HBscFv活性下降 ;PAS糖显色结果表明 ,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。

重组虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ在巴氏毕赤酵母中的表达及纯化

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化 ,具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX Ⅰ进行多步纯化 ,首先将分泌到培养上清的rHWTX Ⅰ进行 90 %饱和度的 (NH4) 2 SO4沉淀 ,再用截留分子量 3kD的滤膜脱盐 ,再用CM阳离子交换层析分离 ,最后用C1 8反相层析脱盐纯化 ,真空干燥后得到的rHWTX Ⅰ经TricineSDS PAGE ,质谱鉴定 ,氨基酸组成分析 ,N 端序列测定及活性鉴定 ,证明已获得高纯度的重组HWTX Ⅰ ,摇瓶表达量约为 80mg L ,约占总分泌量的 2 3.6 % ,并对摇瓶发酵条件进行了优化 ,为利用基因工程方法生产HWTX

戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白在巴氏毕赤酵母中的胞内表达与纯化的初步研究

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗 ,利用甲醇营养型酵母 pichiapastoris表达系统表达戊型肝炎病毒 (HEV)结构区ORF2蛋白。采用PCR方法从HEVcDNA中扩增得到的ORF2基因克隆到酵母表达载体pPIC3.5K上 ,构建成重组质粒 pPIC3.5KORF2。该质粒转化酵母菌GS115 ,经G418筛选得到高拷贝转化子。转化菌株经Mut表型鉴定后 ,用含甲醇的培养基诱导表达 ,SDS PAGE及ELISA筛选高表达活性菌株 ,放大培养后进行亲合层析纯化。在该系统中成功地表达了高生物活性的HEVORF2蛋白 ,经亲和层析纯化后扫描分析重组蛋白分子量约为 5 9kD ,纯度可达 96 %。Westernblotting证实 ,它与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。HEV结构区ORF2蛋白在甲醇营养型酵母中的成功表达 ,以及初步纯化得到的具有强免疫学活性的重组蛋白 。

巴氏毕赤酵母SMD1168表达人溶菌酶的发酵条件

研究用毕赤酵母SMD1168菌株(MutS,HIS4+)表达人溶菌酶(HLZ)的发酵条件。此菌株具有对胞外分泌的外源蛋白不降解、对反应器氧传递效率的限制不敏感的特性,有利于在常规反应器条件下的过程放大。在培养基中添加复合维生素,在流加甲醇溶液中添加山梨醇或甘露醇可维持细胞正常的生长和代谢,并表达高活性的HLZ。采用恒溶解氧的方式流加甘油溶液以提高细胞密度,在一段时间内使细胞处于碳源半饥饿状态后,使用恒速流加甲醇溶液诱导HLZ表达。HLZ的体积生成速率达到9.6mg/(L·h)左右,上清液中HLZ的含量约为1.6g/L,发酵周期为110h。

巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展

巴氏毕赤酵母表达系统具有优良的特性,是目前广泛应用的微生物表达系统之一,它在理论研究和实践应用上尤其是在大规模发酵中具有重要的意义。本研究综述了巴氏毕赤酵母的生物学和遗传学特性,详细阐述了巴氏毕赤酵母表达系统的组成以及影响外源基因表达的因素,并提出了一些提高表达量的方法。

巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展

巴氏毕赤酵母表达系统具有真核生物表达的特点。本文综述了巴氏毕赤酵母菌及其表达载体的特点以及外源基因在该系统中表达存在的一些问题。

外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略

高效表达外源蛋白 ,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义 ,巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一 .影响外源蛋白在P .pastoris中表达的因素很多 ,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面 ,了解和灵活运用它们的联系 ,有助于获得外源基因在P .

日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建

目的 扩增SjCL2基因 ,构建巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2 ,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法 运用RT -PCR技术 ,从日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因 ;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒 ;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果 利用RT -PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约 1Kb大小的SjCL2基因 ,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB中。 结论 成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB

影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素

要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量 ,必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括 :外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。本文就这些因素进行分析 ,并提出一定的对策和建议。

应用巴氏毕赤酵母高效表达基因工程药物的策略

巴氏毕赤酵母表达体系是近年发展起来的真核表达体系,具有良好的应用前景。本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略。

外源基因在巴氏毕赤酵母中的表达

近年来 ,巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的 :探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素 2融合蛋白在巴氏毕赤酵母 (P .Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法 :用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf(+) HBScFv IL 2上扩增出来 ,再亚克隆到酵母表达载体pPICZаA中 ,转化P .Pastoris宿主菌GS 115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子 ,重组酵母经甲醇诱导后 ,通过SDS PAGE及Western blot分析鉴定表达产物 ;再通过亲和层析法纯化目的蛋白 ;用间接ELISA实验鉴定其活性。结果 :表达的重组蛋白分子质量约为 4 4ku ,表达量可达 12 % ;纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95 % ;重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL 2单克隆抗体特异性结合。结论 :成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL - 2融合蛋白酵母表达工程菌 ,并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。

重组毕赤酵母表达期菌体浓度的软测量模型

建立了用于在线估计高密度重组毕赤酵母培养过程中处于表达阶段的菌体密度软测量模型。分别对比了基于遗传算法(GA)的动力学软测量模型以及基于人工神经网络(ANN)的软测量模型,并对神经网络软测量模型的拓扑结构以及训练参数进行了初步探讨。当采用基于遗传算法(GA)的动力学模型,模型拟合值的最大误差为7.63%;在采用神经网络软测量技术时,选取合适的模型结构和输入参数,最大误差为3.12%,而且软测量模型可以很好地反映菌体浓度实时变化趋势。该研究结果表明,在酵母细胞的高密度培养过程中采用基于神经网络的软测量模型具有较高的准确度,可以较好地实时反映发酵过程中菌体浓度的变化。

HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物纯化

中试规模生产可溶性重组人抗HBsAg单链抗体 (HBscFv) ,分泌表达HBscFv的巴氏毕赤酵母 (P .pastoris)工程菌在 30L发酵罐中进行补料分批培养 .上清中的HBscFv以离子交换及免疫亲和层析两步法进行纯化 .发现酵母工程菌经 7d补料分批培养后 ,6 0 0nm波长下的光密度值 (OD6 0 0 )达到 334,目的蛋白表达量为 2 6 0mg/L .纯化后 ,可获得纯度为95 %的HBscFv ,产量为 171mg/L .活性测定结果表明 ,HBscFv制品的比活性为 (2 5 2±0 17) μg- 1,与大肠杆菌来源的HBscFv无明显差异 .

核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN,并检测其抗肿瘤活性。方法利用DCN的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN基因,与载体pPIC9K连接,将序列正确的重组体扩增后,酶切线性化,通过醋酸锂法转化酵母菌HIS-/GS115,G418筛选阳性克隆,用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达,并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)增殖的影响。结果表达产物作用于HepG2细胞后,与对照组相比,细胞增殖数量及速度均显著降低。随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用也增强,并表现出浓度和时间依赖性关系。细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体,并表达了有活性的蛋白产物。

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。

毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定

为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶(GOD)酵母表达菌株,优化了GOD的T132S/T56V双突变编码序列,将之克隆到表达载体p GAP_k上得到表达载体p GAP_k-h_2-GOD,以p GAP启动GOD基因的表达。将p GAP_k-h_2-GOD上的p GAP启动子替换为p GCW14和p AOX1,并对p GCW14启动子进行改造,得到3种p GCW14的改造体,最终得到包括p GAP_k-h_2-GOD在内的6种不同启动子的重组表达载体。将这6种载体转化毕赤酵母GS115,建立了一种简便高效的筛选方法初步筛选出GOD重组菌株,再对筛选到的转化子进行发酵培养,测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱。结果显示:p GCW14的启动效率是p GAP的3~5倍,改造后的启动子p GCW14+G20A/C-467T(0.767)和p GCW14-UA(0.689)的启动效率较原始的p GCW14(0.574)都有明显的提高,尤其p GCW14+G20A/C-467T启动效率最高,比原始p GCW14提高了32.5%左右。与诱导型启动子p AOX1(1.187)相比,p GCW14+G20A/C-467T(1.109)的启动效率仅比其低6.6%左右。结论:改造后的启动子可望在毕赤酵母组成型高效表达的研究应用中具有一定的前景。

重组质粒pPIC9K-oLHαhCGβCTP的构建及在毕赤酵母中的表达

将人绒毛膜促性腺激素β－亚基的羧基肽（ＣＴＰ）与羊黄体生成素（ｏＬＨ）的α－亚基融合，通过设计两对引物，用部分重叠聚合酶链式反应（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ）的方法构建了羊的α亚基ＣＴＰ嵌合体．这个嵌合体被克隆到ｐＰＩＣ９Ｋ质粒中，用电打孔方法转入巴氏毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ），并获高效表达．表达蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明分子量约为２８ｋＤ．２．５Ｌ发酵罐大量培养，产量可达２．０ｇ／Ｌ．