巴泰病毒N_(5aa-90aa)重组肽段的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科成员,其核衣壳N蛋白具有高度保守性,可诱导机体产生较好的抗体反应,常用做诊断抗原。本研究通过对N蛋白强抗原性肽段N_(5aa-90aa)进行密码子优化,将其插入到pET-32a(+)载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,通过不同IPTG浓度和诱导时间确定最佳蛋白表达条件。利用镍柱亲和层析方法对rHis-N_(5aa-90aa)肽段进行纯化。通过Western blot对rHis-N5aa-90aa肽段进行验证,将rHis-N_(5aa-90aa)肽段免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价。结果显示:本研究成功构建了pET-32a-N_(5aa-90aa)重组质粒,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、37℃诱导5 h可获得大量重组蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示重组rHis-N_(5aa-90aa)肽段分子质量约28.6 kDa,蛋白浓度为0.256 mg/mL;经Western blot分析纯化的rHis-N_(5aa-90aa)肽段与His-tag抗体呈阳性反应,证明rHis-N_(5aa-90aa)成功表达,间接ELISA测定制备的兔抗N_(5aa-90aa)肽段多克隆抗体的效价为1∶25600,并且Western blot和间接免疫荧光分析其具有良好的特异性。本研究表达并纯化了BATV的rHis-N_(5aa-90aa)肽段,为BATV的ELISA诊断方法的建立和基因疫苗的研制奠定基础。

云南首次分离到辛德毕斯(Sindbis)、巴泰(Batai)和Colti病毒

目的了解云南省虫媒病毒分布情况,为防治提供依据。方法在云南省思茅地区和西双版纳州采集蚊虫以及发热病人血清,液氮冻存。标本常规处理,接种C6/36细胞和乳鼠以分离病毒,并用血清学和分子生物学方法对分离到的病毒进行鉴定。同时采集发热病人和健康人血清,用ELISA和血凝抑制试验检测病毒抗体。结果从西双版纳发热病人血清中分离到1株辛德毕斯(Sindbis)病毒,从澜沧县菲律宾按蚊中分离到1株巴泰(Batai)病毒,从思茅市翠云区和澜沧县三带喙库蚊、中华按蚊、菲律宾按蚊、迷走按蚊等蚊虫中分离到10株Colti病毒。血清抗体检查,西双版纳发热病人血清中辛德毕斯病毒抗体阳性率为2.50%(3/120),巴泰病毒抗体阳性率为4.17%(5/120);思茅和西双版纳地区健康人血清中辛德毕斯病毒抗体阳性率为1.93%(11/571),其中澜沧、思茅、景洪、勐腊和勐海的阳性率依次为4.55%(6/132)、0.89%(1/112)、1.25%(2/160)、1.96%(2/102)和0.00%(0/65);西双版纳发热病人和脑炎病人血清中还检测出Colti病毒抗体。结论云南省分布有经蚊虫传播的辛德毕斯、巴泰和Colti病毒,当地人群中也存在该病毒自然感染。今后应加强这3种虫媒病毒病的调查研究和防治工作。

鸭巴泰病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及部分地区的初步流行病学调查

为建立检测新发现的鸭巴泰病毒(BATV)感染的血清学方法及初步了解相关地域BATV的流行情况,本研究以浓缩纯化的BATV ZJ-01株作为包被抗原,通过优化反应条件,建立了BATV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,该方法仅与BATV阳性血清发生特异性反应,而对禽流感病毒等8种常见鸭病毒阳性血清无交叉反应,表明其特异性强;经敏感性试验测定,阳性血清1∶320倍稀释时检测仍为阳性,显示其敏感性高。批内重复试验变异系数低于5%,批间重复试验变异系数低于10%,证明其重复性良好。经30份血清样品的比对检测结果显示,该方法与中和试验符合率为100%。应用该方法对采自闽浙赣三省发生产蛋下降种(蛋)鸭群、生长不良肉鸭群共493份血清样品分别检测,结果总阳性率高达29.41%。本研究为BATV的流行病学调查提供了一种特异、敏感、快速的血清学检测方法。

巴泰病毒云南株生物学性状研究

目的掌握巴泰(Batai)病毒生物学特性,为巴泰病毒的监测和调查研究提供科学依据。方法用分离自云南省菲律宾按蚊(Anopheles philippinensis)的巴泰病毒LC92-4株,采用细胞培养、小白鼠感染、血凝抑制、间接免疫荧光、空斑试验以及病理检测和电镜观察等方法进行生物学特性试验。结果巴泰病毒可引起<4周龄小白鼠发病死亡。感染鼠脑病毒颅内、皮下和腹腔接种2周龄小白鼠的LD50分别为5.67logLD50/0.025mL、5.3logLD50/0.03mL和4.5logLD50/0.03mL。感染病毒鼠的心、肝、脾、肺、肾病毒悬液颅内接种2周龄小白鼠,LD50分别为3.75、4.25、2.25、3.0、2.25logLD50/0.025mL。感染发病小白鼠脑、心、肝、脾、肺、肾均发现病理改变。感染鼠的脑组织经电镜检测发现圆形有包膜病毒颗粒,大小约82nm。巴泰病毒能在BHK21和Vero细胞产生明显病变,并可产生空斑;在BHK21细胞上,空斑滴度为6.04logPFU/mL;在C6/36细胞上不产生病变。感染病毒鼠脑接种BHK21和Vero细胞,TCID50分别为5.50logTCID50/0.025mL和5.00logTCID50/0.025mL。在pH5.75～7.0条件下,巴泰病毒不具有与鸽、鹅、鸡、鸭、人O型和绵羊红血球发生凝集的特性;空斑减少中和试验检测云南省357份人血清,阳性2份,中和抗体滴度均为1∶10。结论乳小白鼠和幼年小白鼠对巴泰病毒高度易感。BHK21和Vero细胞对巴泰病毒敏感,可用于病毒分离培养和空斑测定。建立的免疫荧光和空斑减少中和试验具有特异性,可用于巴泰病毒抗体检测。应进一步开展该病毒的分布及其与疾病关系的研究。

鸭巴泰病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)的快速检测方法,本研究基于该病毒囊膜蛋白(M)基因序列的保守区域,经优化反应条件,对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了测定,建立了一种用于检测BATV的一步法RT-PCR快速诊断方法。所建立的检测方法可特异性扩增出BATV M基因480bp的序列片段,其最低检测病毒量为1×10^(1.1) TCID_(50),且重复性好,对禽坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等5种鸭常见传染病病原均未扩增出相应的片段,特异性好。以上结果表明,所建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性和敏感性,可用于鸭BATV感染的早期快速诊断及流行病学调查。

种番鸭源巴泰病毒的分离及鉴定

为确定引起种番鸭产蛋下降的病原,本研究应用透射电镜负染及理化特性测定等方法对1株分离自表现产蛋下降的283日龄种番鸭卵巢的病毒(ZJ1408株)进行研究,结合RT-PCR检测及序列分析结果,确定所分离病毒为布尼亚病毒属的巴泰病毒(BATV)。该病毒可在鸭胚成纤维细胞和Vero增殖并引起细胞病变。对病毒核蛋白部分序列测定与分析发现,该病毒与已发布的鸭源分离株ZJ14、牛源分离株XQ-B及NM/12核苷酸序列同源性在99.5%以上,与近年来报道的基因重配变异株Ngari的同源性为92%左右;遗传进化分析表明,该病毒株与早期蚊虫源BATV分离株MM2222、G-20217及804986等同处于亚-非基因型进化分支。以上结果表明我国饲养的鸭群存在BATV感染,这提示应充分重视该类人畜共患病病原在家禽中流行的监测。

鸭巴泰病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,研究根据鸭BATV非结构蛋白(NSs)基因特征,设计引物,经条件优化后建立检测BATV感染的qRT-PCR方法。用建立的qRT-PCR方法对临床72份疑似BATV感染的病料进行检测,并对阳性样品进行病毒分离,评价两种方法的符合率。结果表明,当病毒NS基因含量为3.59×10~2~3.59×10~7拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.9994,扩增效率为98%。最低检测限为3.59×10~2拷贝/μL;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(81.60±0.16)℃,对鸭源常见病毒(如鸭甲肝病毒、禽坦布苏病毒、禽Ⅰ型副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒)检测均为阴性,组内变异系数和组间变异系数分别为0.49%~1.99%和0.58%~2.18%。临床送检的72份病料SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的阳性率为4.17%(3/72),并分离到2株鸭源BATV,2种方法的阳性符合率为66.67%(2/3)。建立的基于SYBRⅠ检测BATV的qRT-PCR方法、特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于BATV的分子流行病学研究。

牛巴泰病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

本研究以牛巴泰病毒(BATV)NM/12株作为诊断抗原,初步建立了BATV间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测方法,并对反应条件进行初步优化。结果表明,该方法对赤羽病毒阳性血清、牛布鲁氏杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清无交叉反应,仅与BATV阳性血清发生特异性反应,表明其特异性较强;经敏感性试验测定,阳性血清1∶640倍稀释时检测仍为阳性,显示其敏感性高。应用该方法对内蒙古自治区、黑龙江省和吉林省的523份牛血清进行牛巴泰病毒血清流行病学调查,总阳性率为10.7(56/523),阳性检出率与临床普遍使用的中和试验符合率为100%。本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为牛群抗体检测和BATV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

巴泰病毒研究进展

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科布尼亚病毒属成员,在世界范围内广泛存在。BATV可通过蚊虫传播给家畜、野生动物、家禽甚至人类等,并引起非特异性发热、脑膜炎和家禽产蛋量下降等症状。BATV基因组分3个节段。因此,可发生基因重配现象,产生新毒株并引起人类的发热甚至死亡,给公共卫生安全带来严重威胁。本文对BATV的病原学、临床症状、诊断和疫病防控等方面进行了简要的阐述,以期为预防和控制病毒的出现和流行提供参考。

巴泰病毒G1_(189aa-239aa)肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒(Batai virus,BATV)G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189-239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_(189aa-239aa),转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_(189aa-239aa)肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_(189aa-239aa)肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_(189aa-239aa)肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_(189aa-239aa)肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_(189aa-239aa)肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_(189aa-239aa)肽段特异性较好。以rHis-G1_(189aa-239aa)肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10000。样品D450 nm值≥0.367为阳性,D450 nm值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_(189aa-239aa)肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。

我国首次分离巴泰病毒的分子生物学鉴定

目的对从云南蚊虫中分离的YN924病毒进行分子生物学鉴定,从分子生物学水平明确其分类地位。方法扩增YN924病毒的S片段并测序,通过ClustalX(1.8)、Phylip、Treeview(3.2)软件对S片段的序列进行分析,并构建种系发生树;对S片段编码产物N蛋白及NSs蛋白的氨基酸顺序进行分析。结果用两对引物均可从YN924病毒扩增出产物,序列分析发现S片段与巴泰病毒(X73464)的同源性最高,为96.4%;N蛋白、NSs蛋白的氨基酸顺序与巴泰病毒的同源性分别为99.1%和98%。结论从云南分离的YN924病毒属于巴泰病毒,我国首次对该病毒进行分子生物学鉴定。

中国分离巴泰病毒基因组全编码区序列测定和分析

采用RT-PCR和TAIL-PCR方法,首次对我国分离的巴泰病毒(YN92-4株)基因组的全编码区进行序列测定和分析。结果显示,YN92-4株病毒基因组由S、M、L三个片段组成,长度分别为947、4 371、6 860个核苷酸。其中,S片段基因编码由234个氨基酸残基组成的核衣壳蛋白和由102个氨基酸残基组成的非结构蛋白,M片段基因编码由1 435个氨基酸残基组成的前体蛋白,L片段基因编码由2 239个氨基酸残基组成的RNA聚合酶。与国外其它地区的巴泰病毒分离株进行基因组全编码区序列比较后发现,YN92-4株与日本牛血清分离株(ON-7/B/01株)在S、M片段核苷酸(氨基酸)的同源性最高,分别为97.7%(100%)和95.7%(98%);由于本研究首次开展对巴泰病毒L基因片段核苷酸序列的研究,因此国际基因库尚无可参考的序列信息,本研究比较了我国分离的巴泰病毒与同一血清组的代表病毒Bunyamwera病毒L片段的核苷酸和氨基酸序列同源性,分别为73.5%和81.6%。系统进化分析显示,YN92-4株基因组与其它巴泰病毒分离株在各自分支下形成独立分支。本研究提示我国分离的巴泰病毒YN92-4株未发生基因重配(如Ngari病毒),其基因组与日本牛血清分离株(ON-7/B/01株)的亲缘关系密切。

巴泰病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用Taq Man实时荧光定量PCR技术,建立巴泰病毒(Batai virus,BATV)实时荧光定量PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的BATV基因序列资料分析结果,在其S片段编码非结构蛋白的基因区段设计BATV特异引物与探针,利用不同科、属的13株病毒核酸验证方法特异性,利用体外转录的定量RNA标准品建立基因拷贝数定量分析模型,重复实验检验方法的稳定性。结果引物与探针具有良好的特异性,定量分析模型的灵敏度为10拷贝/μl,同一样品重复检测循环阈值的变异系数均<2.50%。结论建立了一种特异、灵敏、高效的BATV一步法Taq Man实时荧光定量PCR检测方法,为今后该病毒的检测与研究工作提供技术手段。

巴泰病毒单克隆抗体的制备及鉴定

巴泰病毒(Batai virus,BATV)是一种人兽共患病毒,近年在全球广泛流行。我国也有人和动物感染的相关报道,而目前对BATV的研究仅局限于分子检测和全基因测序,还没有关于BATV单克隆抗体的相关研究,但制备特异性强、活性好的单克隆抗体也是防控BATV的关键。为了制备BATV单克隆抗体,本研究利用纯化的BATV作为抗原免疫雌性BALB/c小鼠,制备鼠源单克隆抗体。通过免疫小鼠后断尾取血,间接ELISA测其血清效价后,将SP2/0细胞与小鼠的脾细胞融合。ELISA方法筛选阳性细胞株,并进行亚克隆后制备单抗腹水,并利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水。结果获得7株单克隆抗体,包括5株IgG型和2株IgM型。其中制备的3E2单克隆抗体效价最高为1∶32 000。经间接ELISA、间接免疫荧光和Western Blot检测表明,制备的3E2单抗具有较好的纯度、活性和特异性,为BATV快速检测方法的建立及致病机制研究奠定了基础。

巴泰病毒诱导小鼠神经母细胞瘤细胞凋亡

为探究巴泰病毒(Batai virus,BATV)在体外能否引起小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)凋亡,本试验利用BATV(NM/12)株感染N2a细胞,主要通过WST-8法检测细胞感染后的活性,IFA确定细胞内的BATV。再利用Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞感染BATV不同时间和剂量后诱导细胞凋亡的情况。而且进一步通过Caspase-3活性检测分析BATV对细胞凋亡通路中主要调控分子的影响。WST-8试验结果显示,BATV感染可引起N2a细胞活性明显下降,IFA检测发现绿色荧光主要存在于细胞胞浆中,证明BATV可在N2a细胞中复制。流式细胞仪检测发现,BATV可诱导N2a细胞发生早期和晚期凋亡,并且凋亡程度随着病毒含量和感染时间的增加而加大。另外,Caspase-3活性检测结果显示,BATV在感染细胞过程中可活化凋亡相关因子Caspase-3,进一步证明BATV可以诱导N2a细胞凋亡。结果表明,BATV可诱导N2a细胞发生凋亡,并且能够促进细胞凋亡蛋白Caspase-3表达水平上升,为深入探究BATV调控神经细胞凋亡的分子机制及抗病毒药物的研制奠定了基础。

刘兴祚兄弟事迹始末

刘兴祚先于孔(有德)、耿(仲明)、尚(可喜)归后金,曾一度受到清太祖努尔哈赤的重用,对后金国作出了一定的贡献。天聪初,为抵制和反抗满州(女真)贵族推行的民族高压政策,附明抗清(后金),率其兄占据以皮岛为中心的东南沿海岛屿,威镇东江,成为活跃在明清之际政治舞台上叱咤风云的人物之一。

论清(后金)五次人关及其战略思想

明清(后金)战争,在我国古代军事史上占有重要地位。它以战役频繁无歇、规模宏伟、悲壮激烈及其持续时间之久而载入史册。其中又以清(后金)五次千里奔袭关内(1644年前),写下了震撼人心的一页。清(后金)屡次奇迹般的成功远袭,对于明清兴亡关系很大,且有很多经验可供借鉴。迄今尚无专文探讨这个问题。本文试图将清(后金)五次入关起因与经过缕析清楚,并从整个明清(后金)战争的范围考察其战略思想,揭示其后果对历史演变之影响,亦能有助于我们关于明清兴亡历史过程的必然性认识。

呼图白集

“呼图白”系阿拉伯语(khutbah)的音译,又译“虎图白”、“胡土白”等,意为“讲话”、“演说词”。其复数为“呼泰卜”(khutab),亦有写作“虎托布”,即“一些讲话”之意。宣讲“呼图白”的人,阿拉伯语称为“海推布”(khatib),亦可译为“演讲师”、“演说家”。从伊斯兰教意义上说,它是一种教务职称,专指每星期五聚礼前和开斋节、宰牲节会礼后,站在讲坛(Minbar,敏拜尔)的阶梯上宣讲教义的人。中国操汉语的穆斯林将这种宣讲俗称为“念呼图白”。《呼图白集》(Diwān al-khutab al-Minbariyah),亦可译作《讲坛演说集》或《讲坛文集》,为十世纪著名伊斯兰教学者、演讲大师伊本·努巴泰(Ibn Nubātah,946～984)所编著。作者全名为阿卜杜拉希姆·本·穆罕默德·本·伊斯梅尔·本·努巴泰·法里基,生于迈亚法里津(Mayyāfāriqin,今土耳其迪亚巴克尔境内),后迁居叙利亚阿勒颇。他精通阿拉伯文学,曾长期担任“海推布”,在宣讲教义方面具有丰富的经验,在当时的叙利亚、伊拉克、埃及等地享有盛名。其所著《呼图白集》共收有“呼图白”五十二篇,系按照伊斯兰教历(属太阴历)每年一至十二月的先后顺序编排的,每月四或五篇,专供各个主麻日演讲时使用,专用于开斋节和宰牲节的各一篇,另有一篇名叫“呼图白·奈尔特”