大鼠血脑锰含量与中脑基底神经节中5-羟色胺多巴胺的关系

16只大鼠,随机分4组,其中1组空白对照,3组均腹腔注射硫酸锰染毒后,测血锰和中脑、基底神经节中5-羟色胺、多巴胺、锰的含量。发现血锰含量与5-羟色胺呈负相关(P<0.01和 P<0.05);与多巴胺含量相关不明显(P>0.05)。中脑和基底神经节中锰含量与多巴含量没有相关关系(P>0.05)。

Hedgehog信号通路阻断剂环巴胺体外对佐剂性关节炎大鼠的关节软骨细胞增殖的影响

目的探讨Hedgehog(Hh)信号通路抑制剂环巴胺体外对佐剂性关节炎大鼠(AA)模型的关节软骨细胞增殖的影响和部分机制。方法弗氏完全佐剂诱导AA大鼠,测量关节炎指数和继发性足肿胀度,HE染色观察两组软骨组织生长情况;取AA大鼠踝关节软骨组织,采用胰蛋白酶-胶原酶法分离、培养、鉴定,环巴胺(0、0.05、0.5、5、20μmol/L)体外给药,MTT法检测AA大鼠踝关节软骨细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染检测AA大鼠踝关节软骨细胞凋亡,Western blotting检测AA大鼠踝关节软骨细胞Shh、Ptch1、Gli1的蛋白表达。结果弗氏完全佐剂诱导后,与正常大鼠相比,AA大鼠关节炎指数和继发性足肿胀度明显升高,HE染色显示,AA大鼠踝关节软骨组织有破坏;甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原鉴定体外成功培养AA大鼠踝关节软骨细胞;体外给药环巴胺(0.05、0.5、5、20μmol/L)可升高AA模型关节软骨细胞增殖,流式细胞检测结果显示,环巴胺能降低AA模型软骨细胞凋亡率;与未用环巴胺组相比,环巴胺(0.5、5、20μmol/L)给药对AA软骨细胞中Hh信号通路相关蛋白(Shh、Ptch1、Gli1)表达显著下降。结论弗氏完全佐剂诱导建立AA大鼠模型成立,体外给药环巴胺可抑制AA大鼠软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的凋亡,该作用与抑制AA大鼠软骨细胞Hh信号有关。

环巴胺对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞增殖凋亡的影响及其抗凋亡机制

目的研究Hedgehog(Hh)信号通路阻断剂环巴胺对佐剂性关节炎(AIA)大鼠关节软骨细胞增殖凋亡的影响及抗凋亡机制。方法弗氏完全佐剂诱导AIA大鼠模型,胰酶-胶原酶法分离培养关节软骨细胞,环巴胺体外给药处理AIA软骨细胞,MTT法检测细胞增殖,DNA电泳、Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,RT-PCR检测Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达。结果环巴胺(0.08、0.4、2、10、50μmol/L)剂量依赖性地提高AIA软骨细胞增殖。AIA组可见凋亡细胞DNA梯状条带,环巴胺(0.4、2、10μmol/L)给药组的梯状条带明显减少;AIA组存在核碎裂与染色质固缩,环巴胺给药组均匀蓝色荧光的细胞数量增多;流式分析结果表明AIA软骨细胞凋亡率显著升高,环巴胺明显减少细胞凋亡率;与正常组相比,AIA组软骨细胞中Hh信号通路相关基因(Shh、Ptch1、Gli1)mRNA表达显著升高,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达显著下降,而促凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表达明显升高。环巴胺体外给药能抑制Hh信号通路过度活化,提高Bcl-2 mRNA表达,并降低Bax、Caspase-3 mRNA表达。结论环巴胺体外给药能促进AIA软骨细胞的增殖,并抑制AIA软骨细胞的过度凋亡;该抗凋亡作用和调节Bcl-2、Bax和Caspase-3表达密切相关,提示干预软骨细胞Hh信号通路对保护类风湿关节炎关节软骨具有潜在的治疗意义。

异甾体生物碱——环巴胺的研究进展

环巴胺(cyclopamine)为从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱,对Hedgehog信号通路有抑制作用,在抗肿瘤方面表现出良好的活性。环巴胺发现以来的研究包括以下部分:(1)环巴胺的发现和历史;(2)环巴胺的理化性质;(3)环巴胺的来源;(4)环巴胺对Hedgehog信号通路的作用;(5)环巴胺的研究展望。

环巴胺诱导大肠癌Caco-2细胞凋亡效应和线粒体蛋白质组学研究

目的:探讨环巴胺对大肠癌Caco-2细胞的促凋亡效应,在线粒体蛋白水平阐明其作用机制。方法:取对数生长期大肠癌Caco-2细胞分为环巴胺处理组及阴性对照组,以5、10、20和40μmol.L-1环巴胺处理Caco-2细胞,分别应用MTS法及流式细胞术测定Caco-2细胞生长抑制率及凋亡率,采用nano LC-ESI-MS方法检测环巴胺处理组与阴性对照组细胞线粒体蛋白质组学差异。结果:环巴胺处理组Caco-2细胞分别经10、20和40μmol.L-1环巴胺作用24、48和72 h后,生长抑制率(分别为23.1%±1.8%,46.2±0.9%,53.4±2.3%;45.1%±2.8%,73.0%±2.5%,81.2%±1.6%;59.7±2.3%,87.5±1.4%,91±1.06%)明显高于阴性对照组(1.8%±0.2%,2.5%±0.1%,3.7%±0.3%)(P<0.01);经5、10、20和40μmol.L-1环巴胺作用于Caco-2细胞48 h后,细胞凋亡率分别为24.1%±1.3%、31.7%±1.6%、50.5%±2.3%和64.0%±1.9%,明显高于阴性对照组(14.4%±0.7%)(P<0.01)。蛋白质组学差异分析,环巴胺作用后,Caco-2细胞线粒体共有32种蛋白表达下调,25种蛋白表达上升,这些蛋白功能主要涉及细胞凋亡、细胞骨架、核酸、核糖体及蛋白质代谢等,其中与凋亡关系密切的蛋白包括ATF6、Clusterin、OPA1、RGD1565411和Cofilin。结论:环巴胺通过阻断Hedgehog(HH)通路,抑制大肠癌Caco-2细胞增殖,其机制与促进细胞凋亡有关;环巴胺可明显改变Caco-2细胞线粒体蛋白表达,其差异与凋亡关系密切。

环巴胺对DU145细胞增殖和细胞周期的影响

目的:研究Hedgehog信号通路阻断剂(环巴胺)对DU145细胞增殖的抑制作用。方法:不同浓度(1、10、50、100μmol/L)环巴胺干预DU145细胞,分别在24、48、72h后采用噻唑蓝比色法检测其对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测环巴胺对细胞周期的影响;RT-PCR检测50μmol/L环巴胺作用48h后实验组和对照组细胞周期蛋白E(cyclinE)mRNA表达水平的差异。结果:环巴胺对DU145细胞的抑制作用呈时效和量效依赖关系,当浓度>10μmol/L作用24h后会显著抑制细胞增殖,10、50、100μmol/L浓度组对细胞的抑制率分别为7.42%、12.70%和59.15%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测发现,当环巴胺浓度达10μmol/L以上,干预48h后G1期细胞比例明显升高。对照组、10、50μmol/L浓度组的G1期细胞百分比分别为:(52.17±2.21)%、(60.13±2.75)%和(74.30±3.52)%,差异有统计学意义(P<0.01);凋亡峰也随环巴胺浓度增加而逐渐增高。50μmol/L环巴胺作用48h后DU145细胞cyclinEmRNA表达显著降低,与空白对照组相比降低61.90%(P<0.01)。结论:环巴胺可以抑制DU145细胞的增殖能力,其机制可能与下调DU145细胞cyc-linEmRNA表达水平,从而将DU145细胞阻滞于G1期有关。环巴胺亦可以诱导DU145细胞凋亡。

环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响

目的:探讨环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响。方法:采用MTT法检测环巴胺对BGC-823细胞的生长抑制效应,倒置显微镜及AO/EB荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Shh、Gli-1 mRNA的表达情况。结果:环巴胺可明显抑制BGC-823细胞的生长,呈时间-剂量依赖性,并出现典型的细胞形态学改变;经32、64、96μmol.L-1的环巴胺作用24 h后的凋亡率依次为12.50%、31.50%、56.10%,明显高于空白对照组的2.10%(均P<0.01);Shh及Gli-1 mRNA均表达,环巴胺可下调Gli-1 mRNA表达,但对Shh mRNA表达无明显影响。结论:环巴胺可以抑制胃癌细胞BGC-823增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Gli-1基因表达有关。

环巴胺对人食管癌EC109细胞转移的影响及作用机制

目的探讨环巴胺特异性阻断人食管癌EC109细胞Hedgehog(Hh)信号通路后对其转移能力的影响及其可能的机制。方法环巴胺处理EC109细胞48 h后,采用Transwell小室、血管生成实验观察细胞的迁移、侵袭及血管形成等转移能力,RT-PCR检测Gli-1mRNA的表达,Western blot检测Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表达。结果环巴胺阻断Hh信号通路能显著减弱EC109细胞迁移、侵袭及血管形成能力(P<0.05);Gli-1mRNA表达量降低,Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表达量均降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论环巴胺能显著抑制EC109细胞的转移能力,其可能机制与抑制Gli-1进而使下游MMP-9、VEGF表达下调有关。

环巴胺抑制Shh信号对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨环巴胺靶向抑制Shh信号对乳腺癌细胞增殖、凋亡以及Survivin表达的影响。方法采用荧光定量PCR法检测乳腺癌组织及癌旁正常组织中Shh、PTCH1及GLi1的表达,MTT法检测不同浓度环巴胺对人乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制的影响,流式细胞术检测环巴胺对MCF-7细胞凋亡的影响,Western blot检测环巴胺处理前后MCF-7细胞GLi1和Survivin的表达。结果 Shh、PTCH1及GLi1在乳腺癌组织中均呈高表达;不同浓度环巴胺均可抑制MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡;环巴胺处理后GLi1和Survivin的表达均降低。结论 Shh信号在乳腺癌组织中呈激活状态,靶向抑制Shh信号可抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡,其可能通过抑制Survivin表达发挥作用。

环巴胺对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和凋亡作用及对PCA3基因表达的影响

目的:探讨环巴胺对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和凋亡的作用及对PCA3基因表达的影响。方法:不同浓度环巴胺(1、5、10、15μmol/L)干预LNCaP细胞,以只加入RPMI 1640培养液为空白对照组,分别在不同作用时间(24、48、72h),用MTT法检测其对细胞增殖的抑制、流式细胞术观察细胞凋亡率变化、Hoechst染色观察凋亡细胞形态变化、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)观察对PCA3基因表达的影响。结果:5、10、15μmol/L环巴胺对LNCaP细胞增殖均有显著抑制作用,与空白对照组相比差异有显著性(P<0.01),10μmol/L组于48h达到半数抑制量(IC50);10、15μmol/L组24、48、72hLNCaP细胞的凋亡率分别为37.21%、57.38%、57.98%和21.16%、71.31%、72.90%,与空白对照组相比差异均有显著性(P<0.01)。随着环巴胺浓度增大和作用时间的延长,LNCaP细胞凋亡显著增加。PCA3基因的表达随着环巴胺浓度的上升呈现明显的递减趋势,较空白对照组显著降低(P<0.01)。浓度为10μmol/L时,不同作用时间PCA3基因的表达均极低。结论:环巴胺浓度为10、15μmol/L作用48、72h时能够明显抑制LNCaP细胞的增殖,诱导细胞凋亡,并显著下调LNCaP细胞PCA3基因的表达。

多西紫杉醇联合环巴胺抑制脑胶质瘤生长的实验研究

原发性中枢神经系统肿瘤中，神经胶质瘤（多发生在脑部）是颅内最常见的恶性肿瘤，约占脑部恶性肿瘤的80％，且极易复发[1]。因此，探讨合理的脑胶质瘤治疗方式以提高患者生存期一直是学者们努力的方向。

环巴胺对前列腺增生症大鼠细胞增殖与凋亡的影响

目的:观察环巴胺对前列腺增生症大鼠细胞增殖与凋亡的影响。方法:将30只BPH大鼠随机分为模型组(BPH组)和环巴胺组(Cyclopamine组),未造模的15只大鼠为正常对照组(Normal组)。Cyclopamine组大鼠腹腔注射环巴胺,Normal组和BPH组腹腔注射等剂量生理盐水,1次/d,连续7d。给药结束后处死大鼠,获得各组大鼠的前列腺组织,并对其进行各项指标的测定。结果:与Normal组相比,BPH组和Cyclopamine组的前列腺湿重、体积及前列腺指数显著升高(P<0.05);腺上皮呈乳头状增生,腺体数量增多,腺腔变大,间质和血管扩张充血水肿;前列腺细胞凋亡小体表达率明显降低(P<0.05),细胞增殖速率明显增高(P<0.05)。与BPH组相比,Cyclopamine组前列腺湿重、体积及前列腺指数显著降低[(3.18±0.28)比(2.03±0.22);(2.30±0.26)比(1.45±0.27);(0.78±0.23)比(0.46±0.17)](P<0.05);前列腺组织病理学改变改善明显;凋亡小体表达率明显上升[(3.17±0.68)比(5.25±0.77)](P<0.05);间质、上皮细胞增殖速率明显降低[吸光度4d(1.35±0.09)/(1.62±0.17)比(0.94±0.11)/(1.26±0.15);5d(2.24±0.16)/(2.73±0.27)比(1.74±0.17)/(2.16±0.20)、细胞数目4d(21.57±1.89)/(31.32±2.54)比(17.88±1.26)/(25.44±2.39);5d(33.66±3.16)/(44.97±4.29)比(29.14±2.42)/(39.75±3.82)](P<0.05)。结论:环巴胺能够抑制前列腺增生症大鼠前列腺上皮细胞和间质细胞的增殖,促进细胞凋亡的发生。

环巴胺对人胃癌SGC-7901细胞中β-catenin及E-cadherin基因表达的影响

目的探讨异甾体类生物碱药物环巴胺对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制作用及对β-catenin和E-cadher-in基因表达水平的影响。方法体外培养人胃癌SGC-7901细胞,MTT法观察环巴胺在不同浓度及不同时间对细胞的生长抑制作用;AO/EB染色荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学改变;应用流式细胞仪检测细胞周期各时相分布情况;采用RT-PCR法检测β-catenin、E-cadherin基因mRNA的表达情况。结果 MTT法显示环巴胺对SGC-7901细胞生长有显著抑制作用,其作用强度与剂量和作用时间呈正相关,且各组间比较差异有显著性(P<0.05)。环巴胺作用24 h后,荧光显微镜下观察到典型的凋亡细胞形态改变。流式细胞分析结果显示环巴胺作用后G0/G1期细胞比例明显增高,S期细胞比例明显下降,细胞阻滞在G0/G1期,各组间比较差异显著(P<0.05)。SGC-7901细胞中β-catenin mRNA呈高表达、E-cadherin呈低表达,环巴胺可下调β-catenin mRNA表达水平,上调E-cadherin mRNA表达水平,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论环巴胺可诱导SGC-7901细胞凋亡;SGC-7901细胞中β-catenin及E-cadherin存在异常表达,环巴胺抗肿瘤作用机制可能与下调Wnt信号通路的β-catenin表达、上调E-cadherin表达有关。

1-甲基-4-苯基-吡啶盐致多巴胺能细胞系MES23.5的死亡机制

通过测定环境毒素1-甲基-4-苯基-吡啶盐(MPP+)作用于多巴胺能细胞系MES23.5后细胞存活率的变化及细胞线粒体膜电位(△ΨM)、活性氧(ROS)、羟自由基、超氧化物岐化酶(SOD)的变化,发现MPP+作用于多巴胺能细胞系MES23.5,可导致细胞存活率显著性减少,浓度达到200mol／L以上后,细胞存活率的下降呈时间与MPP+浓度依赖;以200μmol／LMPP+作用细胞6-48h后,△ΨM逐渐下降、ROS、羟自由基逐渐增加,48h后SOD开始显著性减少。结果表明早期线粒体能量代谢障碍和膜电位变化导致ROS(尤其是羟自由基)含量增加是MPP+导致多巴胺能细胞氧化应激的原因,而细胞内自由基的清除机制受损,则最终导致细胞变性死亡。

盐酸异波巴胺的合成和工艺改进

以 3,4 二甲氧基苯乙胺为原料 ,经N 苄基化、N 甲基化、脱甲基、酯化、脱苄及成盐反应合成盐酸异波巴胺 ,并采用“一锅烩”法合成重要中间体N 苄基 N 甲基 3,4 二甲氧基苯乙胺氢溴酸盐。合成实验中以价格便宜的Ni代替昂贵的Pd/C作催化剂或者采用NaBH4作还原剂 ,脱甲基反应中 ,由加压反应改为常压反应 ,操作简便 ,成本低 ,该工艺适合于工业化生产。产物的结构经红外光谱、质谱、核磁共振氢谱和元素分析确证。

环巴胺对胃癌MKN45细胞株VEGF、MMP-2、MMP-9基因表达的影响

目的:研究环巴胺诱导胃癌MKN45细胞凋亡的作用及其对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的影响.方法:以胃癌MKN45细胞为研究对象,MTT法检测不同浓度环巴胺作用不同时间对M K N45细胞的增殖抑制作用.应用流式细胞仪测定细胞凋亡率及细胞周期分布.RT-PCR检测环巴胺对VEGF、MMP-2、MMP-9mRNA表达的影响.结果:不同浓度(7.5、15、30、60、90、120mol/L)的环巴胺对人胃癌MKN45细胞均有增殖抑制作用,且呈时间和剂量依赖性.30、60、90mol/L环巴胺作用MKN45细胞24h后凋亡率分别为18.45%±0.57%、39.77%±0.61%、68.52%±0.89%,明显高于阴性对照组的细胞凋亡率2.08%±0.49%,差异具有统计学意义(P<0.05).细胞周期分析显示,随着环巴胺浓度升高,G0/G1期细胞比例逐渐增多,S期细胞比例逐渐减少,细胞发生G0/G1期阻滞(P<0.05).RT-PCR检测显示环巴胺作用24h后,VEGF、MMP-2、MMP-9mRNA的表达明显下降,且随着药物浓度的增高表达量逐渐减少(P<0.05).结论:环巴胺对胃癌细胞MKN45具有明显的增殖抑制及促凋亡作用,其机制可能与下调肿瘤侵袭转移相关基因VEGF、MMP-2、MMP-9的表达有关.

环巴胺衍生物的研究进展

环巴胺是一种hedgehog信号通路抑制剂,对人类多种肿瘤细胞具有显著抑制作用,通过对环巴胺结构修饰及改造,有效地提高了其水溶性和抗肿瘤生物活性。本工作综述了近些年来对环巴胺结构修饰及改造的研究进展,并展望了环巴胺衍生物结构修饰更多类型,未来在抗肿瘤方面发挥更大作用。

高效的多巴胺能神经元原代培养方法及其影响因素的研究

目的:建立一种简单高效的中脑多巴胺神经元细胞原代培养方法,并观察胰酶消化对中脑多巴胺能神经元突起生长的损伤作用。方法:以Nakai等经典神经元细胞原代培养方法为基础,通过使用低日龄胎鼠,初次培养液加入胎牛血清等步骤,促进中脑多巴胺能神经元细胞贴壁和生长;在无胰酶消化组直接使用内口外翻的小口径硅化吸管轻柔吹打离散细胞,比较两种方法间神经元细胞突起形成的差异。结果:接吹打组其多巴胺能神经元细胞突起的生长程度(212±10μm)明显高于胰酶消化组(113±9μm)(P<0．01),而两组间多巴胺阳性细胞比例未见显著差异(P>0．05)。结论:在中脑多巴胺能神经元细胞原代培养中,低日龄胎鼠及免胰酶消化离散细胞可减少神经元细胞损伤,有利于细胞突起的生长。

响应面法优化毛叶藜芦环巴胺的提取工艺

采用响应面法优化了从毛叶藜芦中提取环巴胺的条件。在单因素实验的基础上选取提取液料比,提取时间和提取温度为随机因子,以环巴胺提取量为响应值,建立三因素三水平Box-Behnken中心组合设计,并建立数学模型对响应值进行分析。结果表明,提取液料比、提取时间和提取温度对环巴胺的提取量都有极显著(p<0.01)的影响,并确定了最佳的提取工艺参数为:提取液料比9∶1(mL/g),提取时间10.0h,提取温度48.0℃。在此优化条件下,提取10.0g毛叶藜芦得到环巴胺的理论量为9.38mg,实际提取量为9.19mg,相对误差为2.02%。

毛细管气相色谱法测定巴胺磷溶液含量

建立了毛细管气相色谱法测定巴胺磷溶液含量的方法。试验采用6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷为固定相的毛细管柱,柱温240℃,进样口温度250℃,FID检测器温度250℃,载气为氮气,流速3 mL/min,进样量1μL,分流比15∶1,内标物质为邻苯二甲酸二丁酯。在该色谱条件下,巴胺磷峰与内标物质峰分离度良好,方法平均回收率为103.5%(n=9,RSD=1.7%),重复性RSD为0.6%,定量限为2.5μg/mL,巴胺磷在0.025~0.5 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系(r^(2)=0.9999),不同色谱柱、柱温、流速、进样口温度、检测器温度耐用性良好。结果表明,建立的方法专属性好、快速、准确,可用于测定巴胺磷溶液的含量。