巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究

以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP。利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株。用EGFP标记菌接种小麦‘小偃107’种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况。结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦‘小偃107’植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势。研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用。

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD PCR法克隆了巴西固氮螺菌 (Azospirillunbrasilense)Yu6 2的nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源 (96 5 % ) ,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为 97 6 %。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7nifA- 突变株的Nif- 表型。研究了NH4+ 和O2 对Yu6 2nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明 :nifA基因在Yu6 2菌株中是部分组成型表达的 ,氨和氧不能完全阻遏其表达 ,在 5mmol LNH4 Cl与微氧 (0 5 %O2 )条件下表达最高 ;NifA蛋白在 0 4%～ 0 5 %O2 时活性最高 ,氧分压降低和提高都使NifA活性下降 ,1mmol LNH4 Cl足以抑制NifA的活性。

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析

用卡那霉素盒（Ｋｍｒｃａｓｅｔｅ）插入法，对巴西固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）Ｙｕ６２的ｄｒａＴＧ基因及其下游区域进行了诱变，并获得相应的突变株。研究表明：ｄｒａＴ变突株的固氮酶活性不再受铵抑制，而ｄｒａＧ突变株在有铵时则丧失固氮酶活性，但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。ｄｒａＴＧ下游区域突变株ＹＺ４（突变位点距ｄｒａＧ约２ｋｂ）在无氮及限铵条件下，其固氮酶活性比野生型菌株的高，但其ｎｉｆＨｌａｃＺ转录融合子的表达并不受影响。

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植(英文)

将GFPmut2质粒中的gfp基因 (编码绿色荧光蛋白 )克隆到载体pVK10 0中 ,构建成重组质粒pVK10 0 1。将pVK10 0 1通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu6 2中 ,获得GFP标记的巴西固氮螺菌Yu6 2菌株。用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米 (农大 3318)幼苗 ,在接种后 8d、12d ,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测 ,结果表明巴西固氮螺菌Yu6 2菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙。用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明 ,大多数细菌主要定植于根表 。

巴西固氮螺菌Yu62 glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中 ,筛选到glnB基因的阳性克隆 ,将3 7kb/EcoRI+PstI的阳性克隆亚克隆到pUC1 9中 ,进行了全序列分析 ,其在GenBank中的登记号是AF32 3960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因 ,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶 (GS)的glnA基因 ,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长 336bp,编码 1 1 2个氨基酸 ,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达 71 %、77%、79%和 69%。将卡那霉素抗性片段 (Km -cas sette)插入glnB基因的BglII位点 ,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中 ,通过同源重组 ,获得GlnB- 突变株 (glnB ::Km)。为了进一步分析glnB基因的功能 ,将glnB基因的编码区 ( 339bp)构建在pVK1 0 0中 ,置于Km启动子下组成型表达 ,形成重组质粒pVK -II。将重组质粒pVK -II转入到GlnB- 突变株 ,构建成互补株C -glnB(glnB ::Km/glnB)。对GlnB-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明 ,GlnB- 突变体无固氮酶活性 ,即表型为Nif- ;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK -II分别转移到野生型Yu62?

巴西固氮螺菌Yu62draTG基因及其下游区域的克隆与核苷酸序列分析

以ＡｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７４．０ｋｂｄｒａＴＧ片段为探针，自Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＹｕ６２的基因文库中克隆了约８ｋｂ的ｄｒａＴＧ同源片段。通过对该片段的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析发现Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＹｕ６２的ｄｒａＴＧ基因定位在３０ｋｂＥｃｏＲＩＫｐｎＩ片段上，其上游与ｎｉｆＨ基因相邻。ＤＮＡ序列分析结果表明：该片段含有完整的ｄｒａＴＧ，这两个基因下游还有两个开放阅读框架（ＯＲＦ３和ＯＲＦ４，其中ＯＲＦ４是不完整的），ｄｒａＴＧ及下游的ＯＲＦ３推测以一个操纵元的方式转录；在ｄｒａＧ及ＯＲＦ３的上游区域均发现σ５４依赖型启动子的特征序列（ＤＰＥ及ＵＡＳ），推测它们与ｄｒａＴ共转录外，还有可能单独转录。同源比较的结果表明Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍ的ＤｒａＴＧ是非常保守的，它们在菌株及种间的差异都很小；紧接着ｄｒａＧ的ＯＲＦ３除与Ａ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ和Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｕｍｒｕｂｒｕｍ相应位置的ＯＲＦ同源外，还与Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉ的ＯＲＦ１４同源；

巴西固氮螺菌Yu62 glnB基因和glnZ基因的克隆和序列分析

gln B基因编码的 PII蛋白在巴西固氮螺菌的固氮过程中起着非常重要的调控作用 ,而 gln Z是与gln B高度同源的基因 ,其产物 Pz可能也在固氮调控中起作用。本研究用 PCR法克隆了巴西固氮螺菌 Yu6 2gln B基因和 gln Z基因。 DNA序列分析表明 gln B和 gln Z这 2个基因的编码区的长度都为 336 bp,编码 112个氨基酸。将巴西固氮螺菌 Yu6 2菌株与标准菌株 Sp7的 gln B基因和 gln Z基因分别进行比较 ,结果表明这 2个菌株的 gln B基因在编码区的核苷酸顺序完全相同 ,而 gln Z基因在长 336 bp的编码区内有 4个碱基发生变化 ,但改变后都是同义密码子 ,即编码的氨基酸并未改变。 gln B基因和 gln Z基因在核苷酸顺序上的同源性高达 73.2 % ,氨基酸顺序的同源性达 6 6 .7%

巴西固氮螺菌 Yu62 draTG 基因启动子区域的核苷酸序列及其功能分析

对巴西固氮螺菌ｄｒａＴＧ上游区域进行了全序列分析，结果表明该区域除了编码部分ｎｉｆＨ基因外（ｎｉｆＨ与ｄｒａＴＧ转录方向相反），不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列，它们包括上游激活序列（ＵＡＳ）、下游启动子组份（ＤＰＥ）和富Ａ＋Ｔ区。这说明：ｎｉｆＨ与ｄｒａＴ间的区域可能主要起调控功能而非编码功能；ｄｒａ操纵元（ｏｐｅｒｏｎ）的启动子很可能是ＲｐｏＮ－依赖型。用ｐＡＦ３００做载体，构建了ｄｒａＴ∷ｃａｍ转录融合质粒ｐＡＴ１，并通过检测Ｃｍｒ以检测ｄｒａＴ在大肠杆菌和巴西固氮螺菌中的表达，结果表明ｄｒａＴ在ＬＤ丰富培养基上，好氧条件下，只在巴西固氮螺菌中才表达。这说明，ｄｒａＴ的转录需要某种大肠杆菌中没有的因子，同时也表明ｄｒａＴＧ上游区域有启动子功能。利用启动子探针质粒载体ｐＣＢ１８２，构建了ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ转录融合质粒ｐＣＴ１。在大肠杆菌中测定肺炎克氏杆菌ＮｉｆＡ对ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ的转录激活作用。结果表明ｎｉｆＡ并不参与ｄｒａＴ的转录调控。

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用 Kado 法只发现一个大质粒,以 pABm 1表示,其分子量约为120 Md;而用改良的 Eckhardt 方法,则发现有5个大质粒,分别以 pABm 1、pABm 2、pABm 3、pABm 4和 pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md 和900 Md,都是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的核酸杂交技术制备了 Biotin-nifHDK 探针,并对 Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了 Southern 印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明 nifHDK 基因定位于染色体上。

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4^+后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4^+后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.

高产吲哚乙酸及高泌氨巴西固氮螺菌的筛选与鉴定

目的:从玉米根际和土壤中分离具有高产吲哚乙酸较强的泌氨能力的巴西固氮螺菌。方法:分别通过半固体NFb培养基、CR培养基、LB培养基分离培养固氮菌株,并经过一系列菌落菌体形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列测定等试验对其进行鉴定。结果:经分离纯化获得10株固氮菌,并鉴定均为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense),其中菌株R7在甘油半固体培养基上能分泌约14mmol/L的氨,在添加了色氨酸的培养基中能够合成58.8μg/ml的吲哚-3-乙酸(IAA)。结论:成功筛选得到一株既高产吲哚乙酸又有较强的泌氨能力的巴西固氮螺菌。

巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -Z分别转移到nifA- 突变株中 ,结果表明glnB和glnZ均不能恢复nifA-

巴西固氮螺菌ntrBC基因的克隆与核苷酸序列分析

以EMBL3为载体,构建了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的基因文库.以巴西固氮螺菌Yu62中PCR扩增出的450bp DNA 片断作为探针,对该基因文库进行筛选,得到了10个阳性克隆(EA1—EA10),其中含有两种不同类型的克隆,分别以EA4和EA9为代表.对EA4的杂交分析发现目的基因位于2.9kb EcoRI片段上.DNA序列分析结果表明该片段含有完整的ntrC编码区,其编码产物由480个氨基酸组成.分子量为53469;ntrC上游是完整的ntrB编码区,其编码产物由400个氨基酸组成,分子量为43487.对相应的NtrC和NtrB氨基酸序列进行同源性分析,说明巴西固氮螺菌与根瘤菌的亲缘关系较与其它自生固氮菌的更为接近.

肺炎克氏杆菌NifA对巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用

用PCR方法克隆了巴西固氮螺菌Yu62nifH的启动子片段,DNA序列分析表明菌株Yu62与标准菌株Sp7之间的DNA序列差异很小。利用启动子探针质粒载体pCB182,构建了3个不同的nifH::lacZ转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌NifA对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌nifH启动子的转录是依赖于NifA的,缺失了上游激活序列的启动子不能被NifA激活转录,肺炎克氏杆菌NifA对其自身nifH及巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用并无很大差异。

巴西固氮螺菌中吸氢酶基因同源性的分子检测

通过TTC(2 ,3,5 氯化三苯基氮唑 )实验筛选出 12株能产生吸氢酶蛋白 (Hup+ )的巴西固氮螺菌 (Azospir rilumbrasilense)菌株。用Qiagen柱分离提纯含豌豆根瘤菌的hup基因片段的质粒 pHVT10 9和pHVT115 ,并用地高辛标记法标记pHVT115 ,与 12株Hup+ 巴西固氮螺菌的总DNA进行斑点杂交 ,结果显示pHVT115所含的吸氢酶基因 (hup基因 )片段与巴西固氮螺菌的大部分菌株的hup基因同源性不强。这一结果表明hup基因在固氮生物中存在着遗传多样性 ,异源hup基因探针不一定都适宜于探测hup基因。

巴西固氮螺菌固氮负调控基因与nifL基因的同源性研究

以棕色固氮菌和肺炎克氏杆菌的nifL基因较保守的N-端区设计了一对PCR引物,对巴西固氮螺菌总DNA进行扩增。序列分析结果表明,扩增片段与棕色固氮菌nifL基因的核苷酸同源性为47.2%,与肺炎克氏杆菌nifL基因的核苷酸同源性为49.1%。由此看来,巴西固氮螺菌与肺炎克氏杆菌和棕色固氮菌的nifL基因同源性很低。

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的表达研究

为了研究巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因与表达载体p VLT-33为基本元件,构建了重组表达载体p VLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)研究了不同温度、不同时间EGFP m RNA的表达情况。酶切及测序结果表明,成功构建了p VLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;q PCR结果显示:30℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体p VLT-EGFP,为实现p VLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。

肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒 pCK3[携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌 Yu62-4菌株在6.0 mmol/L 以上 NH^+_4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无 NH^+_4时活性的0.3—0.5%),而野生型 Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氮酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子 Yu62-4在高 NH^+_4(50mmol/L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无 NH^+_4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株 Yu62在此 NH^+_4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明:外源(来自肺炎克。’氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌 Yu62中不能有效地解除 NH^+_4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。

紫云英根瘤菌及巴西固氮螺菌的氢酶表达特征

紫云英根瘤菌氢酶表达依赖于H_2并受碳底物和高O_2浓度的阻遏及cAMP的显著促进。整体细胞的吸氢活性对O_2不敏感,受碘乙酸(50mmol L^(-1))的强烈抑制。少数氧化还原电位为正值的人工电子受体可支持吸氢活性。与紫云英根瘤菌不同,巴西固氮螺菌氢酶表达并不依赖于H_2,受碳底物阻遏及cAMP促进的效应均不显著,而对O_2敏感。整体细胞吸氢活性受碘乙酸的抑制作用不明显。无论正、负值氧化还原电位人工电子受体均可支持吸氢活性。在经饥饿的静止细胞中,H_2可支持固氮活性并增强固氮酶对O_2的耐受能力。