紫外分光光度法测定肉碱转化液中巴豆甜菜碱的含量

通过对巴豆甜菜碱和L -肉碱在紫外 188- 2 15nm的光吸收的比较 ,建立了紫外分光光度法测定肉碱转化液中巴豆甜菜碱含量的方法 ,测定波长 2 0 5nm ,线性范围 0 - 2 5 μg/ml,该方法快速方便、重复性好 ,可用于L

测定巴豆甜菜碱的新方法及其在肉碱研究中的应用

通过对巴豆甜菜碱紫外吸收特性的研究，建立了一种快速、简便的检测方法。最大吸收波长为265nm，检测范围为0.25～3.5g/L。由于L-肉碱是由巴豆甜菜脱水酶作用下不对称水化合成的，转化液主要成分为肉碱与巴豆甜菜碱，而在265nm处肉碱的光吸收相对巴豆甜菜碱而言极低，因此265nm光吸收检测方法也可应用于肉碱在科研、生产上的快速测定，较一般的肉碱检测方法具有简便、经济的优点。

大肠杆菌转化巴豆甜菜碱合成L-卡尼汀

利用大肠杆菌的卡尼汀代谢途径，建立了以巴豆甜菜碱为底物、酶法制备Ｌ－卡尼汀的新方法。催化巴豆甜菜碱转化的酶是可诱导的胞内酶，既催化巴豆甜菜碱水合，又催化卡尼汀的脱水反应。厌氧培养、在培养基中加入Ｌ－卡尼汀或巴豆甜菜碱都有利于酶的形成。破碎处理后，可同时提高转化速度和转化率。

大肠杆菌巴豆甜菜碱还原酶基因缺失菌株的构建

报道了体外构建caiA基因缺失的带有卡那霉素抗性基因的5.2kb线状DNA分子,以此转化大肠杆菌JM83和BL21(DE3)株,借助于体内DNA同源重组,定向敲除了大肠杆菌中的巴豆甜菜碱还原酶编码基因caiA。经遗传稳定性实验、聚合酶链反应(PCR)以及Southern鉴定,表明所获得的JM83转化子22号和BL21(DE3)转化子4号确为caiA基因缺失突变株;酶活分析结果表明,22号和4号转化子均丧失了巴豆甜菜碱还原酶活性。

不相容双质粒共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅因子合成酶基因caiE

基因 cai B和基因 cai E分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶 ,携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白 ,得到高活性肉碱脱水酶。分别构建这两个基因的表达质粒 p ET2 8cai B和 p ET2 2 cai E,利用双抗生素筛选法 ,获得能稳定遗传的双质粒转化子。经 IPTG诱导 ,两个基因共表达 ,表达量分别占菌体总蛋白的 39%和 2 0 % ,共转化菌的酶活力比 p ET2 8cai B单转化菌提高了 2 .3倍 。

肉碱脱水酶突变株的获得及其休止细胞反应条件的优化

对一株产肉碱脱水酶的菌株用溴化乙锭进行诱变 ,并经肉碱选择性培养基进行筛选 ,获得了一株高活性酶活的菌株 ,并进行了休止细胞转化巴豆甜菜碱为L 肉碱的反应条件的研究。实验确定休止细胞的最适反应温度为 30℃～ 32℃ ,pH8.1、0 .0 1mol L磷酸缓冲液 ,时间 8.5～ 10h。最适底物浓度为 6 0mg ml,最适休止细胞浓度为 6 0mg ml(湿重 ) ,产率 4 0 % (摩尔比 )。建立了休止细胞酶反应的表观米氏方程 ,其中Vm =0 .0 0 12 2 5mol (min·15mg菌体 ) ,Km =0 .0 4 0 114mol L。

产L-肉碱的大肠杆菌基因工程改造及生物转化

L-肉碱在脂肪代谢中起重要的作用,本文构建了T7启动子控制下的过表达质粒p ET28a-cai BCD和p ACYCD-cai F-cai T,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)(简写DE3)中,得到基因工程菌BL21(DE3)/cai BCD+cai F+cai T(简写DE3/BCD+F+T)。将此菌株接种到生长培养基中,并用终浓度为1 mmol/L的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导培养,然后收集菌体细胞加入到含有巴豆甜菜碱盐酸盐的转化液中进行转化。结果显示,IPTG诱导4 h比诱导10 h后转化得到的L-肉碱量要高,转入了过表达质粒的工程菌DE3/BCD+F+T(7.244 g/L)比野生型DE3(0.5 g/L)提高了15倍。该巴豆甜菜碱盐酸盐转化生成L-肉碱的反应在2 h后基本达到稳定。

产L-肉碱的菌种筛选及发酵条件优化

将D ,L 肉碱 (carnitine ,β 羟基 γ 三甲胺丁酸 )用浓硫酸脱水获得反 巴豆甜菜碱 (trans crotonobetaine) ,从本室保藏的菌株中筛选出 1株能将反 巴豆甜菜碱非对称合成L 肉碱的菌株E .coliK74。利用它的休止细胞立体选择性地水合反 巴豆甜菜碱产生L 肉碱 ,起催化作用的酶是L 肉碱脱水酶 ,是一种可诱导的胞内酶 ,当培养基中加入反 巴豆甜菜碱并在部分厌氧条件下可诱导产生。如培养基中含有葡萄糖、硝酸盐或氧时 ,酶的合成受到抑制 ,在磷酸缓冲液中 ,E .coliK74休止细胞的最适反应条件是 :pH为 7.8,温度为 37～ 42℃。