bta-miR-145通过负调控MYO5A参与布莱凯特黑牛骨骼肌发育的机制研究

骨骼肌的发育是畜禽生长过程中的重要阶段,miRNA作为肌肉生成和骨骼肌再生的基本调节因子具有重要作用,本研究旨在探究bta-miR-145参与调控布莱凯特黑牛背最长肌发育的分子机制。采集布莱凯特黑牛和鲁西黄牛背最长肌进行sRNA建库,通过GO功能注释和KEGG富集分析筛选与骨骼肌功能相关的bta-miR-145,生信分析进行保守性分析及预测其靶基因;以布莱凯特黑牛骨骼肌细胞为细胞模型,转染btamiR-145 mimic和inhibitor,48 h后2%马血清诱导并观察分化过程,CCK-8试验和EdU染色法检测细胞增殖率;qRT-PCR检测靶基因MYO5A以及增殖分化标志基因(PCNA、CDK2、Myf5、Myh1)的表达量。结果表明,转染bta-miR-145 mimic可降低布莱凯特黑牛骨骼肌细胞分化(Myf5、Myh1)和增殖(PCNA、CDK2)标记基因的表达(P<0.01),抑制MYO5A的表达(P<0.01),转染bta-miR-145 inhibitor则促进骨骼肌细胞分化和增殖标记基因的表达(P<0.05),促进MYO5A的表达(P<0.01)。综上,bta-miR-145通过负调控靶基因MYO5A抑制牛骨骼肌细胞的增殖和分化而参与骨骼肌的发育过程。

布莱凯特黑牛A-FABP基因表达规律及其肌内脂肪含量研究

本实验旨在探究布莱特黑牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因表达规律,鉴定其与肌内脂肪含量调控的相关性。通过克隆获得A-FABP基因,采用生物信息学方法分析基因结构;利用荧光定量PCR技术研究A-FABP基因在不同组织及不同时期的表达情况;采用PCR-SSCP方法探究基因型与肌内脂肪含量的相关性。结果表明:克隆获得的A-FABP序列与牛、瘤牛、山羊亲缘关系近,同源性高;A-FABP基因在背最长肌中表达量最高,不同时期A-FABP基因的表达量随月龄增加逐渐降低;关联分析显示其多态位点与肌内脂肪含量显著相关(P<0.05),与大理石花纹评分不显著。综上推测,A-FABP基因参与牛肌内脂质代谢相关过程,对调控脂肪的沉积发挥重要作用,可作为肉质性状的辅助标记基因。

布莱凯特黑牛心脏型脂肪酸结合蛋白基因的研究进展

肉质性状与肌内脂肪含量紧密相关。心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein,H-FABP)基因作为影响肌内脂肪含量的候选基因之一,成为布莱凯特黑牛分子育种改善肉质性状的研究重点。作者就H-FABP对脂肪酸转运的调控机理、H-FABP基因定位和结构等方面进行阐述,并结合在不同畜禽上的研究进展进行比较分析,为利用现代分子生物技术培育布莱凯特黑牛新品种提供理论参考。

布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性分析

为研究布莱凯特黑牛PDSS1(decaprenyl diphosphate synthase subunit 1)基因与肉质性状的相关性,采用PCR-SSCP技术对96头布莱凯特黑牛进行单核苷酸多态性检测。经PCR-SSCP检测及克隆测序发现,布莱凯特黑牛PDSS1基因各扩增片段中,P4表现为AA、AB、BB 3种基因型,P9表现为CC、CD 2种基因型,且各存在1个SNP位点:第4个外显子122bp处发生A→G的碱基突变,并引起相应氨基酸的改变(N156S);第11个外显子6bp处发生C→T的碱基突变,但未引起氨基酸的改变。经肉质性状关联性分析发现,AA、AB、BB不同基因型间差异不显著(P>0.05),但AB型的综合肉质指标较好。研究表明,布莱凯特黑牛PDSS1基因各外显子核苷酸序列的稳定性极高;外显子4内的碱基突变可能会引起PDSS1蛋白质空间结构及功能的改变,但与肉质性状相关性不显著。

CoQ_(10)生物合成限速酶及其编码基因对布莱凯特黑牛品种培育的实践意义

辅酶Q10(CoQ10)作为人体线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术研究及应用价值。由ubiA/coq2基因编码的对羟苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶是原核和真核生物CoQ生物合成途径的限速步骤,因此对该酶及其编码基因的研究显得尤为重要。对该酶及其编码基因的研究成果和现状进行综述和展望,旨在为布莱凯特黑牛品种培育的实践研究提供理论指导意义。

布莱凯特黑牛心脏脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性的研究

利用PCR-SSCP方法测定96头布莱凯特黑牛H-FABP基因外显子2和内含子2的部分序列多态性,并对含有多态序列的片段进行了序列分析。结果表明,引物1、3的扩增序列不存在多态性,引物2、4的扩增序列存在多态性;引物2在内含子第323位点处存在G→A突变,在群体中产生了AA、AB、BB 3种基因型,基因型频率分别为0.448、0.146、0.406,多态信息含量(PIC)为0.375,属于中度多态(0.25<PIC<0.5),经χ2检验该位点基因型频率不处于Hardy-Weinberg平衡状态;引物4在内含子2第872位点处存在C→G的突变,产生了HH、Hh、hh 3种基因型,基因型频率分别为0.104、0.417、0.479,多态信息含量(PIC)为0.337,为中度多态(0.25<PIC<0.5),经χ2检验该位点基因型频率达到Hardy-Weinberg平衡状态。

CoQ_(10)-Dps编码基因的研究进展及其在布莱凯特黑牛分子育种中的应用

CoQ10作为生物细胞呼吸链中的重要递氢体,广泛存在于动植物及微生物体内,是人体唯一可利用的CoQ类,而Dps(十聚异戊二烯焦磷酸合成酶)是决定其类别的关键酶。CoQ10在脏器(心脏、肝脏、肾脏)、牛肉、豆油、花生等食物中含量较高,摄入1.0 kg牛肉或1.5kg花生均可提供约30 mg CoQ10。因此,利用CoQ10合成过程中的各类关键酶编码基因对布莱凯特黑牛进行分子遗传标记辅助育种的研究,有助于促进高档优质肉牛新品种的培育。简要概述了CoQ10和CoQ10-PPP(聚异戊二烯焦磷酸)侧链的生物合成,并对其关键酶Dps编码基因的研究现状及在布莱凯特黑牛分子育种中的应用进行评述。

布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因克隆测序及表达分析

为研究布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因序列和表达情况及其与生长发育的关系,本实验运用克隆测序方法检测CRTC1、CRTC3基因CDS区,并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织和不同月龄的mRNA相对表达量;并用免疫组化技术对蛋白进行定位分析。结果显示:克隆测序获得的布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因CDS区分别为1773 bp和1725 bp,分别编码590、575个氨基酸;运用生物信息学分析后发现CRTC1、CRTC3结构稳定性差,为亲水性、偏酸性蛋白;进化树显示与牛、瘤牛、山羊和绵羊的同源性高(>80%),蛋白互作网络图显示CRTC1、CRTC3蛋白与FoxO基因家族、AMPK家族等基因相互作用强。qRT-PCR结果显示CRTC1、CRTC3基因分别在睾丸和脂肪中mRNA相对表达量最高(P<0.01),在肌肉组织中亦有表达。在肌肉组织中,CRTC1、CRTC3基因mRNA相对表达量随着年龄的增加逐渐降低;免疫组化显示CRTC1、CRTC3蛋白主要在肌肉组织的肌原纤维中表达。以上结果表明,CRTC1、CRTC3基因调控肌纤维生长发育,进而参与肌肉生长发育相关调节。

布莱凯特黑牛脂肪酸代谢调控基因的筛选及验证

为了探索不同牛种牛肉脂肪酸含量,试验采用转录组测序差异基因筛选和富集分析,在已知布莱凯特黑牛与鲁西黄牛的脂肪酸代谢通路中的差异基因是ACADSB基因的情况下,通过荧光定量RT-PCR进行验证。结果表明:布莱凯特黑牛中ACADSB基因表达量比鲁西黄牛高近1倍。说明ACADSB基因能够在一定程度上调控布莱凯特黑牛和鲁西黄牛的脂肪酸含量。

布莱凯特黑牛PID1基因的多态性分析及原核表达

为提高布莱凯特黑牛肉质品质,参照NCBI公布的牛PID1基因mRNA序列设计引物,以117头布莱凯特黑牛为试验材料,提取其眼肌总RNA,通过RT-PCR对布莱凯特黑牛PID1基因cDNA进行克隆测序,对PID1基因的每个外显子进行SNP检测,并分析其多态性。结果显示:布莱凯特黑牛PID1基因cDNA全长2 561bp,包括1个612bp的完整开放阅读框,编码203个氨基酸;在第2外显子上存在2处变异位点,但仅1处位点的突变引起氨基酸序列变化,表明PID1基因在种内保守性较强。

布莱凯特黑牛MYPN基因克隆测序及表达分析

实验旨在研究布莱凯特黑牛MYPN基因CDS区序列和表达情况,探讨MYPN基因理化性质及表达规律,为探究其与肌肉生长发育关系奠定基础。克隆结果表明:MYPN基因CDS区全长2 841 bp;进化树结果显示:布莱凯特黑牛MYPN基因与牛(100%)、绵羊(97.57%)、山羊(97.50%)同源性高;生物信息学分析表明:MYPN编码946个氨基酸,为亲水性不稳定碱性蛋白;qRT-PCR结果显示:MYPN在背最长肌中表达量最高;免疫组化显示:MYPN主要在肌浆内的肌原纤维中表达;Western Blot结果显示:MYPN蛋白在肌肉中表达量最高。综上,MYPN参与肉牛肌肉生长发育的调节,可作为肉质性状辅助标记基因。

布莱凯特黑牛PDSS1基因的克隆测序及生物信息学分析

对布莱凯特黑牛PDSS1基因cDNA进行克隆测序,为进一步研究PDSS1基因与布莱凯特黑牛胴体内CoQ10含量、肉质性状等的相关性提供理论基础。针对Ensembl公布的牛(参照)PDSS1基因中11个外显子,设计9对引物,对布莱凯特黑牛基因组DNA进行PCR扩增、克隆测序;利用软件Lasergene 7.0拼接出PDSS1基因cDNA,提交至GenBank并进行生物信息学分析。结果表明:布莱凯特黑牛PDSS1基因cDNA全长1 574 bp,包括一个长1 257 bp的完整开放阅读框,编码418个氨基酸。PDSS1蛋白含5个跨膜区,信号肽由26个氨基酸组成,成熟肽由392个氨基酸组成。布莱凯特黑牛与牛(参照)、海福特牛、马、猪、犬、小鼠、黑猩猩、人在编码区核酸序列同源性依次为99.9%、99.8%、89.0%、83.1%、88.6%、81.1%、80.8%、80.9%;推导氨基酸序列的同源性依次为100%、99.8%、92.0%、81.8%、91.6%、79.0%、80.4%、80.7%。本试验成功克隆了布莱凯特黑牛PDSS1基因cDNA,并提交至GenBank(登录号:KC787698)。布莱凯特黑牛与牛(参照)、海福特牛在PDSS1基因编码区的同源性极高,聚为一类;与马、犬、猪、小鼠、人、黑猩猩等物种的同源性相对低些。

布莱凯特黑牛CoQ_(10)合成相关基因COQ2 cDNA克隆及其多态性分析

COQ2基因是真核生物中对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶的编码基因,该酶是CoQ10生物合成过程的主要限速酶。试验根据已公布的普通牛COQ2基因序列和其cDNA序列,对COQ2基因的7个外显子区域进行引物设计。PCR产物克隆测序后,使用生物信息学软件对测序结果进行比对和拼接,得到布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA序列,并对其外显子3进行了PCR-SSCP分析。结果表明:布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA序列长1 546 bp,由7个外显子组成,氨基酸编码序列为第46 bp至1 161 bp处,编码371个氨基酸;与普通牛相比,布莱凯特黑牛PPT氨基酸第324位由天冬氨酸(N)突变为组氨酸(H)。SSCP检测发现外显子3中存在一个多态位点,在102 bp处发生A→T的碱基突变,产生了AA、AB、BB三种基因型,分析发现AB基因型频率最高,B等位基因频率(0.533)比C等位基因(0.467)高,为优势等位基因。该位点多态信息含量(PIC=0.374)为中度多态。该结果为进一步分析COQ2基因SNP位点与布莱凯特黑牛CoQ10合成情况及肉质性状的关联性奠定了基础,对布莱凯特黑牛品种培育具有重要的指导意义。

布莱凯特黑牛COQ3基因克隆与多态性分析

辅酶Q10是一种醌环类化合物,在哺乳动物细胞内广泛存在并对机体多种生理功能的发挥起重要作用。COQ3基因编码的氧-甲基转移酶催化辅酶Q10合成过程中两步重要甲基化反应。为了检测COQ3基因的多态性,为其作为分子标记辅助育种的候选基因提供依据,首先对布莱凯特黑牛COQ3基因进行了测序分析,经其CDS序列与Gen Bank(ID:540298)数据中已公布的安格斯牛该基因序列进行比对,结果显示同源性为99.9%;将布莱凯特黑牛COQ3序列与山羊、马等9个物种的序列做进化树分析,结果显示布莱凯特黑牛与山羊处在进化树同一枝上并且距离也最近。其次以88头布莱凯特黑牛为试验材料,对每个外显子进行SNP分析,结果发现,只在第5号外显子上存在1处多态位点,但该位点的突变并未引起氨基酸序列的变化,结果显示COQ3基因在种内保守性较强。对COQ3基因编码蛋白质做了结构预测,以便分析该蛋白质如何发挥转甲基功能。

布莱凯特黑牛CB1基因克隆测序及表达分析

本试验旨在研究布莱凯特黑牛CB1基因CDS区序列和表达情况,探讨CB1基因与脂肪沉积的关系。运用RT-PCR技术克隆CB1基因CDS区序列,并进行生物学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织的mRNA相对表达量;以及运用免疫组化技术对蛋白进行定位分析,运用Western blot技术检测CB1蛋白在不同组织的表达量。结果显示,克隆获得的布莱凯特黑牛CB1基因CDS为1495 bp,编码477个氨基酸。进化树显示布莱凯特黑牛CB1基因与牛、山羊、绵羊同源性最高(>98%)。qRT-PCR结果显示CB1基因在不同组织均有表达,在脂肪组织中相对表达量最高;免疫组化显示CB1基因主要在脂肪细胞膜上表达;Western blot结果显示CB1蛋白在脂肪组织和肌肉组织均有表达,在脂肪组织表达量显著高于肌肉组织。综上推测,CB1基因参与脂质代谢相关调节过程,为肉牛肉质性状的分子选育提供参考。

基于转录组筛选肉牛骨骼肌差异基因

旨在基于转录组筛选肉牛骨骼肌差异基因,探究差异基因对骨骼肌转录调控的影响,鉴定其与肌肉生长发育的关系,为研究骨骼肌生长发育的分子机制提供理论依据。采取12月龄的布莱凯特黑牛和鲁西黄牛背最长肌,利用Illumina 2500进行转录组测序,通过综合生物信息学分析(差异基因筛选、GO分类、KEGG富集分析和蛋白互作网络等)筛选骨骼肌差异的调控基因。布莱凯特黑牛和鲁西黄牛2个文库分别存在13 242,13 350个基因,共计13 758个基因。5 500个基因表达量相同,约占总参考基因的39. 98%,8 258个基因表达量有所不同,占比60. 02%。获得554个差异显著的基因作为差异表达基因,其中296个基因表达上调,258个基因表达下调。GO功能注释结果显示,生物学过程、细胞组分和分子功能分别包括22 641,7 720和4 414个基因,其中29个基因与肌细胞的发育和分化有关; KEGG富集到Wnt、CMC、TGF-β、DCM、ROAC、VSMC 6条肌肉生长发育相关通路,筛选骨骼肌候选基因MYL2、MYL3和MYLPF。MYL2、MYL3和MYLPF是Wnt、DMC和TGF-β信号通路中的成员,参与了肌细胞和肌肉组织的形成的过程,推测MYL2、MYL3和MYLPF在骨骼肌生长发育过程中发挥重要作用。

MYL3基因在肉牛肌肉生长过程中的功能研究

为了探究肌球蛋白轻链3(Myosin light chain 3,MLC1v或MYL3)基因对骨骼肌转录调控的影响,鉴定其与肌肉生长发育的功能关系。克隆获得MYL3基因,采用生物信息学方法分析基因结构;利用荧光定量PCR技术研究MYL3基因在不同组织及不同时期的表达情况;应用免疫组化方法,定位MYL3基因在背最长肌中表达的位置;应用蛋白免疫印迹方法,研究MYL3蛋白在不同组织及不同时期的表达情况。结果表明:克隆得到布莱凯特黑牛MYL3基因(序列号:NM_001076501.2)CDS序列全长为600 bp,具有完整的阅读框,编码199个氨基酸;进化树分析发现其同源性较高;基因表达分析显示,在心脏中表达量最高,在背最长肌中表达量次之,其他组织几乎不表达,不同时期MYL3基因的表达量随月龄的增加逐渐增加;蛋白表达分析显示,MYL3蛋白主要在骨骼肌肌原纤维的粗肌丝中表达,不同时期蛋白的表达量随月龄的增加逐渐增加。因此,推测MYL3在促进骨骼肌生长发育过程中发挥重要作用。

MYLPF基因在肉牛肌肉生长过程中的功能研究

试验旨在探究快肌肌浆球蛋白可调节磷酸化轻链(myosin light chain,phosphorylatable,fast skeletal muscle,HUMMLC2B或MYLPF)基因在布莱凯特黑牛各组织中的表达情况,以及布莱凯特黑牛与鲁西黄牛背最长肌中MYLPF基因表达量的变化规律,为探讨其与肌肉生长发育关系奠定基础。以布莱凯特黑牛和鲁西黄牛为研究对象,利用实时荧光定量PCR检测其背最长肌、心脏、肺脏、肝脏、脾脏等10个组织中MYLPF基因的表达情况,并对布莱凯特黑牛和鲁西黄牛2、6、10和12月龄4个不同时期背最长肌中MYLPF基因的表达量变化进行研究。结果表明,MYLPF基因在背最长肌中高表达,在心脏中少量表达,在其他组织中几乎不表达。MYLPF基因在2、6、10和12月龄牛背最长肌中均高表达,但随着年龄的增加MYLPF基因的表达量逐渐降低,2月龄的表达量最高,极显著高于其他3个时期(P<0.01),12月龄表达量最低。4个时期布莱凯特黑牛背最长肌中MYLPF基因的表达量均高于鲁西黄牛,其中10月龄差异极显著(P<0.01),2和12月龄差异显著(P<0.05),6月龄差异不显著(P>0.05)。综上结果表明,背最长肌中MYLPF基因可能对骨骼肌生长发育起调节作用,可为研究肉牛骨骼肌生长发育机理和阐明肌肉生长的分子机制提供参考。

体外诱导牛骨髓间充质干细胞向乳腺样上皮细胞分化的初步研究

为培育转基因肉牛提供种子细胞及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的多向分化潜能,本试验利用细胞免疫荧光染色方法和分子生物学方法初步探讨在表皮生长因子、胰岛素、催产素和孕酮等条件下,体外诱导牛BMSC向乳腺样上皮细胞分化的可能性。利用不同浓度的诱导液对纯化稳定的P4、P8和P12代牛BM-SC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞免疫荧光观察和RT-PCR鉴定。结果显示,诱导后部分BMSC细胞呈多角形,而不再呈明显的梭形和纺锤形,经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。P4代牛BMSC在诱导液Ⅱ的诱导作用下分化效果显著。RT-PCR结果显示,诱导分化后细胞角蛋白19基因、β-酪蛋白基因及αs1-酪蛋白基因在细胞中表达。因此,在体外,多因子联合诱导可使牛BMSC初步分化为乳腺样上皮细胞并且在诱导液Ⅱ的联合诱导下分化作用最明显。

肉牛miR-133a通过抑制PAX7促进成肌细胞分化研究

旨在探究bta-miR-133a参与肉牛调控背最长肌发育的分子机制。通过采集布莱凯特黑牛和鲁西黄牛的背最长肌进行sRNA建库,数据筛选与肉牛骨骼肌发育相关的bta-miR-133a,采用生物信息学分析软件鉴定其保守性并预测其靶基因,对其靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证;选取C2C12细胞进行功能验证,过表达和敲除bta-miR-133a,48 h后2%马血清诱导观察肌管分化过程,CCK-8检测细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测细胞增殖分化标记基因PCNA、CCND1、Myh1、Myod1以及靶基因的表达量。结果表明,bta-miR-133a的成熟序列在各物种间高度保守,靶基因预测为PAX7,经双荧光素酶报告试验验证,bta-miR-133a与PAX7存在靶标关系。GO富集和KEGG通路分析结果显示,预测靶基因显著富集于肌动蛋白细胞骨架组织的调节、经典Wnt信号通路的负调控、肌动蛋白丝结合等GO条目中和MAPK、Ras、FoxO等与肌肉发育相关的信号通路中。过表达bta-miR-133a促进肌管分化(P<0.01),在72 h,降低细胞的增殖率(P<0.01),抑制靶基因PAX7的表达(P<0.01);敲除bta-miR-133a则抑制肌管分化(P<0.01),在72 h时,增加细胞的增殖率(P<0.05),促进靶基因PAX7表达(P<0.01)。在细胞增殖方面,过表达bta-miR-133a降低其标记基因PCNA、CCND1的表达量(P<0.05),敲除组则相反;在细胞分化方面,过表达bta-miR-133a增加其标记基因Myh1、Myod1的表达量(P<0.01),敲除组则相反。综上表明,bta-miR-133a可能通过靶向负调控PAX7的表达抑制成肌细胞增殖、促进其分化而参与背最长肌的发育过程。