布雷菲德菌素A通过激活IRE1-XBP1信号通路增强顺铂诱导的人肺癌GLC-82细胞凋亡

长时间剧烈的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可启动ERS相关通路诱导细胞凋亡;而IREl-XBP1(肌醇需求蛋白1α-X盒结合蛋白1)为高度保守的ERS基本通路。它是最有前景的肿瘤治疗靶点之一。我们研究已证明,布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)能增强顺铂(cisdichlorodiamine platinum,CDDP)的肺癌细胞杀伤作用,但其分子机制尚不清楚。本研究证明了IRE1-XBP1通路在该协同效应中的作用。Annexin V/PI双染结合流式细胞分析显示,与BFA或CDDP单独处理比较,BFA联合CDDP处理能增强人肺癌GLC-82细胞的凋亡。RT-q PCR和Western印迹揭示,与单独处理比较,BFA联合CDDP处理能增强GLC-82细胞的procaspase3转录本(mRNA)和蛋白质的表达,以及procaspase3的裂解激活,进一步证明了BFA联合CDDP处理可增强GLC-82细胞凋亡。最重要的是,RT-q PCR和Western印迹结果证明,与单独CDDP处理比较,BFA处理的GLC-82细胞中IRE1、XBP1水平明显上调(P<0.05),而BFA+CDDP处理的细胞中IRE1、XBP1水平进一步上调,超过BFA组(P<0.01)。结果提示BFA和BFA+CDDP处理细胞可激活ERS的IRE1-XBP1通路。这些结果证明,BFA可通过激活ERS中的IRE1-XBP1通路增强顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。本研究结果为IREl-XBP1是颇具前景的肿瘤治疗靶点提供了新的证据。

产胞外布雷菲德菌素A青霉发酵条件的研究

通过正交设计试验,优化了青霉(Penicillium)属真菌SHZK-15产胞外布雷菲德菌素(B refeld in-A,简称BFA)的液体发酵条件。最佳的BFA发酵条件为:培养基含马铃薯200g(煮汁),葡萄糖20g,(NH4)2SO44.0g,KH2PO41.0g,MgSO4.7H2O 2.0g,CaCO35.0g,pH自然,瓶装量为100mL/250 mL,培养温度为28℃,转速为120 r/m in,培养时间为7d,BFA的最高产量可达151.6mg/L。

法夏内生菌株D126产细胞毒活性物质布雷菲德菌素A的研究(英文)

药用植物法夏内生真菌D126,当进行液体培养时能产细胞毒活性物质,经核磁共振氢谱、碳谱和快原子轰击质谱确定,该物质为布雷菲德菌素A(BFA)。进一步研究表明,BFA对人Burkitts淋巴瘤细胞株Raji、人肝癌细胞株HepG2和人非小细胞肺腺癌细胞株A549具有较强的抑制活性,对植物病原真菌黑曲霉和杨桃炭疽菌等具有抑菌活性。最后,对植物内生真菌产细胞毒活性物质BFA的生态意义进行了探讨。

布雷菲德菌素A通过线粒体凋亡途径增强顺铂抗肺癌细胞的作用

本研究证明了线粒体凋亡途径在布雷菲德菌素A (brefeldin A,BFA)联合顺铂(cisdichlorodiamine platinum,CDDP)抗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的作用。MTT结果显示,BFA对肺癌GLC-82和NCI-H1299细胞的半数有效抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别是100 ng/mL和400 ng/mL,CDDP对GLC-82和NCI-H1299细胞的IC_(50)分别是4μg/mL和15μg/mL;而分别采用半量的BFA和CDDP联合处理GLC-82或NCIH1299细胞后,抑制作用均进一步加强。DAPI染色结果进一步证明了二者的协同作用——与单独用药组相比,细胞核染色质固缩加剧,核裂解碎片增多,乃至形成凋亡小体,表明细胞凋亡的发生。与单药组比较,联合用药导致肺癌GLC-82细胞线粒体膜电位显著下降; q-RT-PCR及Western印迹结果显示,在联合用药早期(24 h),GLC-82细胞可能通过提高Bcl2表达以促进存活;而在联合用药晚期(48 h),细胞已发生不可逆转的凋亡,Bcl2表达受抑制,同时二者通过促进Bax表达来诱导细胞色素C释放,使胱天蛋白酶3发生剪切激活,最终诱导细胞凋亡发生。提示线粒体凋亡途径可能是BFA协同CDDP抗非小细胞肺癌的分子机制之一,为肺癌的临床治疗方案提供了更多的理论依据。

布雷菲德菌素A联合顺铂增强肺癌GLC-82细胞PERK-ATF4通路的激活水平

目的:研究PERK-ATF4通路的激活水平,以探讨布雷菲德菌素A(BFA)与顺铂(CDDP)的协同抗肺癌的分子机制。方法:以BFA、CDDP单独或联合处理人肺癌GLC-82细胞24、48 h,然后用定量PCR和Western Blot检测PERK、ATF4、p-PERK的表达水平。结果 :药物处理24和48 h后,GLC-82细胞PERK的m RNA和蛋白表达水平在CDDP组最低,在BFA组升高(P<0.05),在BFA+CDDP组进一步升高(P<0.01),其磷酸化水平均显著降低(P<0.01);ATF4表达在CDDP组中差异无显著性,在BFA组中升高,在BFA+CDDP组进一步升高(P<0.05或P<0.01),也高于BFA组和CDDP组(P<0.05或P<0.01)。结论 :BFA联合CDDP上调PERK、ATF4水平,该通路可能是BFA与顺铂协同抗肺癌的分子机制之一。

新型抗肿瘤抗生素布雷菲德菌素A的研究进展

布雷菲德菌素A是一种天然存在的大环内酯类抗生素,能有效抑制蛋白质由内质网向高尔基体的转运过程,是一种广泛应用于哺乳动物信号传导研究的分子工具;布雷菲德菌素A具有抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤等生物学活性,布雷菲德菌素A及其衍生物是重要的抗肿瘤候选药。本文综述了布雷菲德菌素A的理化性质、作用机制、生物学活性、生产方法及其结构修饰等方面的研究进展。

（＋）－布雷菲德菌素A的中间体合成研究Ⅱ．闭环反应及相关环戊烷衍生物的制备

利用氰基环氧化物（１）分子内的闭环反应，制备具有抗真菌、抗病毒等生物活性的（＋）－布雷菲德菌素Ａ的重要中间体即（１Ｒ，２Ｒ。

（＋）－布雷菲德菌素A的中间体合成研究Ⅲ．α、β－不饱和酯的合成

（＋）－布雷菲德菌素Ａ的重要中间体——α、β－不饱和酯（８）可以（１Ｒ，２Ｒ，２′Ｒ）－１－（１′－二甲叔丁硅氧基－２′－羟基乙基）－２－氰基环戊烷（７）为原料，经氧化和Ｗａｄｗｏｒｔｈ－Ｅｍｍｏｎｓ反应制得。

（＋）－布雷菲德菌素A的中间体合成研究Ⅰ．7－氰基－1－二甲叔丁硅氧基－2，3－反－环氧庚烷的制备

简述从四氢吡喃丙炔醇（３）和１－溴－４－氯丁烷（４）开始经６步反应制备７－氰基－１－二甲步丁硅氧基－２－，３－反－环氢庚烷（５），此化合物是合成（＋）－布雷菲德菌素Ａ中间体的原料。

真菌代谢产物布雷菲德菌素A的热分析研究

用热重-微分热重法(TG-DTG)和差示扫描量热法(DSC)对氮气气氛中的布雷菲德菌素A进行了热分析研究。结果表明,布雷菲德菌素A在加热到219℃时质量损失约6.41%;219～330℃时质量损失约92.5%;DSC曲线在205.8℃和280.4℃处出现强吸热峰,在207.1℃和290.7℃有两个放热峰。布雷菲德菌素A在179℃以下很稳定,为热分析鉴别布雷菲德菌素A提供了实验依据。

（＋）—布雷菲德菌素A的中间体合成

本文介绍了通过负碳离子在环氧化物分子内的闭环反应，制备具有抗真菌、抗病毒等生物活性的（＋）—布雷菲德菌素Ａ的重要中间体即环戊烷衍生物的过程及有关问题。

布雷菲德菌素A对蕨类植物卵发育的影响

以蕨类模式植物水蕨(Ceratopteris thalictroides L.Brongn.)为供试材料,设置不同质量浓度布雷菲德菌素A(BFA)分别处理10、20、30 h,采用光学显微镜和电镜对其树脂切片进行了观察;在此基础上,进行高碘-酸锡夫反应(PAS)和苏丹黑B反应。结果显示:对照组(未经BFA处理)发育卵中期的水蕨卵细胞较大,核仁呈圆形,细胞内高尔基体、内质网等细胞器完整;卵细胞和腹沟细胞间的受精孔清晰可见,二者间的分离腔内仅有极少量的泡状分泌物;卵膜较厚,有明显的层次。而处理组卵细胞的受精孔和卵膜不典型,由数量较多、大小不一的囊泡组成;受精孔下方有较多的线粒体和少量的高尔基体分布;高尔基体、内质网等膜性细胞器已断裂;细胞核上方和卵膜下方均分布着大量的嗜锇性囊泡,分离腔中充满了絮状物质。组织定位显示:对照组的分离腔较空,而处理组分离腔内充满着多糖类物质。综上所述,BFA会对卵细胞中的内质网和高尔基体等膜性细胞器造成破坏,影响分泌系统的正常功能,进而影响卵膜及受精孔的形成。本研究结果为进一步探索受精孔形成的机制以及蕨类植物生殖生物学的研究奠定了基础。

Eupenicillium brefeldianum CCTCC M 208113发酵液中布雷菲德菌素A分离纯化工艺的研究

目的建立利用溶剂萃取结合冷却结晶技术从发酵液中制备布雷菲德菌素A的提炼工艺,制备高纯度(>99%)布雷菲德菌素A。方法采用HPLC检测方法,以萃取率为指标,选择合适的萃取剂,并优化萃取条件;结合冷却结晶,精制布雷菲德菌素A。结果室温下,预处理后的发酵液经等体积乙酸正丁酯二级萃取,布雷菲德菌素A萃取率95.2%,结合冷却结晶,制得纯度为99.1%的布雷菲德菌素A晶体,工艺总收率59.5%。结论溶剂萃取结合冷却结晶技术纯化布雷菲德菌素A具有工艺简单、收率高、产品质量稳定且易于放大等优点,适合规模化生产。

新型7-O-(芳基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A的合成及其抗肿瘤活性

芳胺与三光气反应制得芳基异氰酸酯(2a^2n);2a^2n分别对布雷菲德菌素A(3)的7-羟基进行结构修饰,合成了14个新型布雷菲德菌素A氨基甲酸酯类衍生物——7-O-(芳基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4a^4n),其结构经1H NMR,13C NMR和ESI-HR-MS表征。初步的抗肿瘤活性测定结果表明,4i^4k均丧失抑制食管癌细胞株TE-1活性。分子对接研究揭示,引入3后,4的分子空间位阻增大,导致不能与靶位结合,致使抗肿瘤活性丧失。

布雷菲德菌素A对HepG2细胞自噬的诱导作用

为探讨新型抗癌药物布雷菲德菌素A(BFA)诱导肝癌细胞发生自噬性死亡的作用机制,以HepG2细胞作为研究对象,将细胞分成阴性对照组、不同浓度BFA组和阳性对照组(雷帕霉素),采用MTT法测定HepG2细胞活性;采用免疫荧光法检测细胞内自噬标志蛋白LC3的表达和细胞核形态学改变;采用Western Blot法检测细胞内激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)、增殖细胞核抗原(PCNA)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关蛋白5(Atg5)、自噬相关蛋白6(Atg6/Beclin-1)的表达水平.结果表明,BFA可引起HepG2细胞内自噬特征蛋白LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1的蛋白表达水平明显增加;同时引起HepG2细胞活性降低、细胞数量减少、细胞核固缩和变形.说明BFA可能引起HepG2细胞发生自噬性细胞死亡.进一步探讨自噬诱导途径发现,BFA引起HepG2细胞内ATF4、CHOP的蛋白表达水平增加.BFA可能通过诱导ATF4和CHOP的过表达引起HepG2细胞发生自噬性细胞死亡.

布雷菲德菌素A诱导人肝癌细胞凋亡的体外研究

目的探讨布雷菲德菌素A(Brefeldin A,BFA)对人肝癌细胞HepG2细胞凋亡的影响。方法用完全培养基(阴性对照组)、0.1%DMSO、0.25 mg/L BFA、1 mg/L衣霉素(Tunicamycin,TM)和0.25 mg/L BFA+1 mg/L TM处理HepG2细胞24 h,MTT法测定细胞活性,流式细胞术检测细胞各组凋亡率,吖啶橙检测试剂盒(AO荧光染色试剂)检测细胞凋亡小体,Western blot法检测细胞内凋亡相关蛋白的表达水平,qRT-PCR法检测细胞内凋亡相关基因的表达。结果形态学观察发现,与阴性对照组相比,0.25 mg/L BFA组细胞明显变得稀疏。细胞活性实验发现0.25 mg/L BFA组,0.25 mg/L BFA与1 mg/L TM联合处理组细胞存活率均明显降低(F=59.766,P<0.05)。流式细胞仪分析发现,0.25 mg/L BFA组,0.25 mg/L BFA与1 mg/L TM联合处理组细胞早期凋亡率明显升高(F=20.738,P<0.05)。AO凋亡小体检测发现,0.25 mg/L BFA组和0.25 mg/L BFA+1 mg/L TM联合组人肝癌细胞HepG2细胞内出现核固缩现象。从蛋白水平来看,与对照组相比,0.25 mg/L BFA组和0.25 mg/L BFA+1 mg/L TM联合组硬酯酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)蛋白表达明显减少,甚至无法检出,聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶-1(poly-ADP-ribose polymerase-1,PARP-1)、半胱氨酸蛋白酶12(cysteine aspartic acid specific protease-12,Caspase-12)蛋白表达升高,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3)活性形式cleaved Caspase-3被检出。基因检测结果显示,与对照组相比,0.25 mg/L BFA+1 mg/L TM联合组SCD1 mRNA表达水平升高(F=19.229,P<0.05);0.25 mg/L BFA组和0.25 mg/L BFA+1 mg/L TM联合组PARP-1、Caspase-12和Caspase-3 mRNA表达水平均明显升高(F=627.475,F=68.640,F=238.742,P<0.05)。结论0.25 mg/L BFA可抑制SCD1蛋白表达,且促进人肝癌细胞凋亡,1 mg/L TM可增强其凋亡诱导作用。

布雷菲德菌素A在脂多糖诱导急性肺损伤中的作用

目的探讨布雷菲德菌素A(Brefeldin A)在脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤中的作用。方法小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)和上皮细胞(MLE-12)分别给予浓度为1、10、100μM的Brefeldin A后,立即用LPS 500 ng/ml处理,收集3、6、9、24 h的细胞上清并测定MH-S中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量和MLE-12中的趋化因子KC值;ICR小鼠随机分为生理盐水组(Normal组)、模型组(LPS组)、地塞米松组(Dex组,5 mg/kg)、Brefeldin A组(BFA组,10 mg/kg),每组12只,气道内2 mg/kg滴入LPS制备急性肺损伤模型,生理盐水组给予等体积生理盐水。6 h后观察肺组织病理改变,测定肺泡灌洗液(BALF)中白细胞、白蛋白含量和TNF-α、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等炎症因子含量,检测肺组织中髓过氧化物酶(MPO)、c AMP含量和MAPK信号通路中ERK、p38和JNK等蛋白激酶分子磷酸化水平的变化。结果 100μM的Brefeldin A能显著减少MH-S中TNF-α的释放和MLE-12细胞中KC的产生(P<0.001)。Brefeldin A显著改善肺组织病理变化,降低BALF中白细胞(P<0.001)和TNF-α(P<0.05)含量,对BALF中白蛋白、IL-1β和IL-6无显著影响,显著降低小鼠肺组织中MPO活性(P<0.05),升高c AMP的水平(P<0.001),同时能显著抑制ERK的磷酸化(P<0.05)。结论 Brefeldin A对急性肺损伤可产生保护作用,其机制与抑制相关炎症因子释放、升高细胞内c AMP的含量、抑制ERK磷酸化等途径有关。

布雷菲德菌素A固体脂质纳米粒的制备及其体外抗肿瘤效果的评价

目的制备布雷菲德菌素A固体脂质纳米粒(brefeldin a solid lipid nanoparticles,BFA-SLNs),并评价其体外抗肿瘤效果。方法采用超声分散法制备BFA-SLNs,正交试验优化处方。测定其平均粒径、多分散指数、Zeta电位、载药率、包封率和体外释放度。采用CCK-8法评价其体外对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用。结果激光纳米粒度仪测定其平均粒径为(185.38±4.74)nm,多分散指数为(0.233±0.03),Zeta电位为(-66.10±2.26)mV,载药率为(7.64±0.28)%,包封率在80%以上,在体外释放度试验中表现出良好的缓释作用。BFA-SLNs对HepG2细胞有较强的增殖抑制作用。结论制备得到的BFA-SLNs粒径均一,分散性良好,包封率较高且具有缓释作用,体外抗肿瘤效果较游离药物强。

内生真菌A1163发酵液中活性成分的分离、纯化与鉴定

目的分离、鉴定植物内生真菌A1163活性次级代谢产物并确定产生菌的生物学分类。方法利用红外光谱、质谱、核磁共振、X-射线衍射分析等技术对目标化合物进行结构鉴定,结合菌株形态观察、分子遗传学鉴定确定菌株的种属关系。结果真菌A1163活性次级代谢产物结构为大环内酯类抗生素布雷菲德菌素A,布雷菲德菌素A产生菌A1163被鉴定属于布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)。

Brefeldin A通过内质网应激途径协同增强顺铂抗肺癌细胞GLC-82作用

已有研究证明,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)启动的未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)信号途径有助细胞存活;然而,长时间剧烈ERS可诱导细胞凋亡,因此,ERS是肿瘤治疗的新靶点。抗癌药物具有严重的毒副作用,而药物的协同作用是减少抗癌药物使用剂量、减少毒副作用的重要手段之一。本研究证明布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)与顺铂(cis-dichlorodiamine platinum,CDDP)的协同抗肺癌细胞的作用。MTT试验显示,单独应用BFA和顺铂时,它们抑制肺癌细胞GLC-82生长的半数有效浓度(IC50)分别是100 ng/m L和4μg/m L;而采用半量的BFA和CDDP联合处理GLC-82细胞24 h后,其抑制生长作用进一步加强;等效线图解法及联合作用指数分析进一步证明二者具有协同作用。两药的这种协同作用进一步被形态学检查证明——与单独用药比较,除了细胞皱缩,出现了更多的染色质固缩,细胞质及细胞核裂解碎片,乃至形成凋亡小体,提示细胞凋亡的发生。实时定量PCR及蛋白质印迹证明,与单独用药比较,联合用药导致内质网应激标志分子GRP78、CHOP表达水平明显增加,提示有内质网应激通路激活。上述结果证明,BFA与CDDP联合用药可增强对肺癌细胞GLC-82的生长抑制作用,其协同机制可能与内质网应激通路的激活有关。我们的结果支持"ERS是肿瘤治疗新靶点"学说,对肺癌的新化疗方案有一定的指导意义。