基于HOOF-Prints技术的布鲁菌疫苗株基因序列遗传变异分析

通过分析布鲁菌疫苗株基因序列遗传变异情况,为疫苗的免疫保护力的评价提供理论依据,本研究利用高变量八聚物寡核苷酸指纹技术(HOOF-Prints)对国内主要布鲁菌疫苗-羊种布鲁菌疫苗M5、猪种布鲁菌疫苗S2、牛种布鲁菌疫苗S19、人用布鲁菌疫苗104M进行序列分析,并基于布鲁菌标准参考株采用软件DNAMAN进行系统进化树分析。结果表明4种疫苗株的基因序列均发生了变异,但系统进化树分析显示这些疫苗株与对应的参考株遗传关系仍然最近,同时表明该指纹技术在分子水平上可以用于分析和了解国内主要疫苗的变异情况,为疫苗的免疫效果提供理论依据。

布鲁菌疫苗株Rev.1全基因序列的测定与分析

为促进布鲁菌病Rev.1疫苗及相关疫苗的研发,该研究提取Rev.1疫苗株核酸,应用PacBio平台进行全基因序列测定与分析。结果表明,Rev.1疫苗株基因组大小约3299187 bp,G+C含量为57.2%,组装为染色体1、染色体2两条环状基因组,大小分别为2121370、1177817 bp,G+C含量分别为57.2%、57.3%。将其Ery、BLS和VirB10基因序列与9株GenBank上发表的布鲁菌参考菌株的Ery、BLS和VirB10基因序列进行比较分析,存在不同程度的差异,同源性为97.4%~100%。

布鲁氏菌A19疫苗株全基因组测序及比较基因组学分析

目的探索布鲁氏杆菌A19疫苗株全基因组的结构、分子生物学的功能,并对其生物信息学进行研究。方法采用Illumina Hiseq 4000和PacBio对A19进行全基因组测序,并与GenBank上的8株菌进行比较基因组学解析。A19基因组3286167 bp,预测3371个基因,GC含量57.25%。通过注释COG库,对应基因有2560个,将其归入22类COG中;根据比对KEGG库,得到2544个基因,共参与33类代谢通路。结果综合两个数据库结果发现,大多数A19预测基因中的基因功能主要与膜运输、氨基酸转运及碳水化合物代谢有关。结论通过分析发现,A19和猪羊牛种布鲁氏菌之间存在一定差异,并找出牛种毒力基因。本实验通过测序A19全基因组,为布鲁菌疫苗的研究提供思路。

布鲁菌疫苗株S2全基因组测序及功能分析

为找出布鲁菌疫苗株S2基因组分泌性蛋白、参与生物学途径基因、细胞组件基因、分子功能基因、毒力相关因子及耐药基因,对布鲁菌疫苗株S2全基因组测序并进行Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测、GO注释、VFDB注释、ARDB注释。全基因组测序结果表明,S2基因组大小约为3.3 Mb,杂合度和重复度较低,GC含量分布未出现异常。通过Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测未找出S2分泌性蛋白。通过GO数据库注释,发现参与生物学途径基因有3 823个、细胞组件基因有1 949个、分子功能基因有2 585个。通过VFDB数据库注释,找出S2基因组有79个毒力相关基因,其中最大基因为8 604bp,最小基因为180bp。通过ARDB数据库注释,找出S2基因组有13个耐药基因,最大基因为3 225bp,最小基因为333bp;其中功能注释的有GL002835基因,是枯草杆菌肽类基因,此基因耐受抗微生物类药物。本研究为进一步了解布鲁菌S2基因组基本功能奠定了基础。

布鲁菌疫苗株A19全基因组测序及功能分析

采用Illumina Hiseq和PacBio测序技术对布鲁菌A19进行全基因组测序,并进行GO注释、VFDB注释、ARDB注释、CRISPR以及基因岛预测等生物信息学分析。结果显示:A19全基因组大小为3.28 Mb,GC含量分布未见异常,含1个CRISPR和16个基因岛,通过GO数据库注释发现,参与生物学途径的基因5 311个、细胞组份基因有3 350个、分子功能基因有3 078个;通过VFDB注释发现,与毒力相关的基因82个,主要包括脂多糖(LPS)、纤连结合蛋白、virB四型分泌系统等毒力相关因子;通过ARDB数据库注释发现,与耐药相关的基因1个,该基因的表达产物通过影响焦磷酸异构酶的表达,从而产生对抗生素的耐药。本试验通过A19全基因组测序,为布鲁菌病的治疗和致病机制的研究及疫苗的开发奠定了基础。

NO/ADMA在布鲁菌侵染小鼠机体过程中的响应特征

本试验旨在研究布鲁菌侵染小鼠过程中一氧化氮(NO)的作用,以及NO和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在此过程的相互作用关系。以布鲁菌标准疫苗株M5侵染小鼠,首先用小鼠的血清进行虎红平板凝集(RBPT)和试管凝集试验(SAT),再用Griess试剂法和ELISA法测定对照组和侵染组不同组织和血清中的NO和ADMA含量,对小鼠肝脏和脾脏的各个侵染时间段进行CFU计数观察。结果显示,用布鲁菌M5侵染小鼠后,RBPT和SAT在14d时检测到有阳性反应。侵染组和空白对照组NO总含量上变化不大,但侵染组血清中的NO含量随时间出现下降,而肝脾中NO含量随时间出现上升,其他各组织NO含量波动不明显。而ADMA的总趋势与NO相反。CFU计数结果显示,小鼠肝脾内布鲁菌的数量在14d时一直处于增长状态,28d时布鲁菌的数量下降,表明布鲁菌的分裂繁殖和机体NO的含量存在一定的关系。

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。