布鲁菌M5侵染小鼠骨髓源性树突状细胞后抗原肽的筛选

【目的】用绿色荧光标记的布鲁菌M5菌株(GFP-M5)侵染小鼠骨髓源性树突状细胞,对成熟树突状细胞表面主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)类分子结合的多肽进行筛选。【方法】用联合细胞因子重组小鼠GM-CSF和IL-4诱导小鼠骨髓单个核细胞向树突状细胞定向分化和增殖,于诱导培养的第1,3,5,7天在倒置荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;用PE标记的CD11c抗体和FITC标记的CD80抗体对培养第7天的小鼠骨髓源性树突状细胞进行标记,流式细胞仪检测树突状细胞表面因子表达情况;用GFP-M5侵染培养第7天的小鼠骨髓源性树突状细胞24 h,激光共聚焦显微镜下观察菌株侵染情况;采用免疫共沉淀技术从树突状细胞膜水溶性蛋白溶液中分离纯化MHCⅡ-免疫多肽组复合物,C18固相萃取柱纯化小分子多肽,应用高效毛细管电泳(HPCE)和液相色谱-二级质谱(LC-MS/MS)联用技术进行纯化和测序,在布鲁菌基因组数据库中对质谱测试原始数据进行检索,筛选与布鲁菌M5基因组匹配的MHCⅡ类结合序列所代表的蛋白质。【结果】倒置荧光显微镜下观察细胞生长状态发现,小鼠骨髓源性树突状细胞由最初表面光滑无突起的圆形细胞(第1天)转变为表面突起明显增多的典型树突状细胞(第7天);经流式细胞仪检测发现,培养第7天的树突状细胞CD11c阳性率为72.0%,CD80阳性率为8.4%,符合未成熟树突状细胞表面标志物的特征。GFP-M5侵染细胞24 h后在激光共聚焦显微镜下可观察到大部分树突状细胞已完全被侵染,即成为成熟树突状细胞;免疫共沉淀结合LC-MS/MS技术,从经GFP-M5侵染的3组树突状细胞膜水溶性蛋白溶液中分离出了800多个MHCⅡ分子提呈的多肽分子,经与布鲁菌全基因组比对,属于布鲁菌且在3个试验重复中至少重复出现2次的有28个多肽序列;蛋白质鉴定表明,这些短肽包括布鲁菌外膜蛋白和外膜蛋白组装过程中需要的相关酶类,以及在抗原递呈过程中细胞内一系列生化反应所需的酶类。【结论】建立了外源性抗原体外侵染树突状细胞,获得了一系列布鲁菌M5菌株侵染小鼠骨髓源性树突状细胞后的MHCⅡ免疫多肽。

NO/ADMA在布鲁菌侵染小鼠机体过程中的响应特征

本试验旨在研究布鲁菌侵染小鼠过程中一氧化氮(NO)的作用,以及NO和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在此过程的相互作用关系。以布鲁菌标准疫苗株M5侵染小鼠,首先用小鼠的血清进行虎红平板凝集(RBPT)和试管凝集试验(SAT),再用Griess试剂法和ELISA法测定对照组和侵染组不同组织和血清中的NO和ADMA含量,对小鼠肝脏和脾脏的各个侵染时间段进行CFU计数观察。结果显示,用布鲁菌M5侵染小鼠后,RBPT和SAT在14d时检测到有阳性反应。侵染组和空白对照组NO总含量上变化不大,但侵染组血清中的NO含量随时间出现下降,而肝脾中NO含量随时间出现上升,其他各组织NO含量波动不明显。而ADMA的总趋势与NO相反。CFU计数结果显示,小鼠肝脾内布鲁菌的数量在14d时一直处于增长状态,28d时布鲁菌的数量下降,表明布鲁菌的分裂繁殖和机体NO的含量存在一定的关系。

IL-2对布鲁菌侵染小鼠巨噬细胞释放细胞因子及吞噬能力的调节作用

为研究白介素2(IL-2)对被布鲁菌M5株侵染的巨噬细胞(MΦ)所释放的细胞因子(TNF-α、IFN-γ和NO)及吞噬能力的调节作用,通过对M5侵染的MΦ添加不同剂量的IL-2,用ELISA试剂盒检测MΦ(侵染的和未侵染的)在不同时间点所释放的细胞因子TNF-α、IFN-γ和NO含量的变化;用CFU涂板法计算胞内活菌数,从而计算巨噬细胞的吞噬指数,以此来探讨IL-2对MΦ在被M5侵染后的免疫调节作用。结果表明,IL-2作用于被M5侵染的MΦ所释放的细胞因子(TNF-α、IFN-γ和NO)的含量与对照组相比有显著的提高(P<0.05),且存在一定的含量和时间的依赖性;IL-2对巨噬细胞吞噬M5的能力在一定程度上有促进作用,随着IL-2含量的增加,胞内活菌数亦增加,存在浓度依赖性。通过试验结果可知,IL-2可以促进MΦ活化,促进MΦ分泌TNF-α、IFN-γ和NO,增强机体免疫应答,为临床应用IL-2研究及治疗布鲁菌病提供新的思路和理论依据。