香芹酚纳米乳液制备及其对腐败希瓦氏菌的抑制作用

【目的】探究使用超声波乳化法制备香芹酚纳米乳液(Carvacrol nanoemulsion,CNE)的最佳条件,并分析CNE抑制腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的作用机制。【方法】通过正交实验优化CNE制备条件,分析乳化剂吐温-80用量、油相占比与超声时间对CNE平均粒径影响,对优化后的CNE进行平均粒径、多分散指数、形态、稳定性与抗菌活性表征,并初步探究其对腐败希瓦氏菌的作用机制。【结果】乳化剂吐温-80体积分数为11%、油相香芹酚体积分数为5%、超声时间为5 min时,CNE平均粒径最小,为(145.83±4.77)nm。优化后制备的CNE在热处理(25~100℃)条件下维持稳定,在pH接近中性时的Zeta电位绝对值较高,且在4℃下最适合贮藏。制备的CNE对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为15.63μL/mL。腐败希瓦氏菌在CNE的处理下,其碱性磷酸酶活性上升,琥珀酸脱氢酶活性下降,蛋白质、核酸泄露量增加。推测CNE是通过破坏细胞壁完整性、细胞膜通透性和能量代谢途径抑制腐败希瓦氏菌生长。【结论】以香芹酚为原料制备的CNE对腐败希瓦氏菌具有较好抑制效果,具备作为鱼类保鲜抗菌剂的潜力。

碳量子点调控希瓦氏菌还原二硝基联苯的机制

土壤中广泛存在的希瓦氏菌(Shewanella)可通过胞外途径还原多种污染物.针对决定胞外还原效率的电子传递关键环节,以奥奈达希瓦氏菌(S.oneidensisMR-1)为模式微生物,研究了生物炭经硝酸氧化释放的碳量子点(CQDs)对该过程的强化规律和机制.发现制备的CQDs呈类球形,粒径为1.5~4nm,表面富含活性含氧官能团.Mtr通路是希瓦氏菌MR-1还原2,2’-二硝基联苯的主要电子传递通路,SirCD蛋白也参与了还原过程;CQDs可促进希瓦氏菌MR-1还原污染物的电子传递,降低污染物对菌体的毒性效应,提高2,2’-二硝基联苯的还原效率.土壤中的针铁矿阻碍希瓦氏菌MR-1还原2,2’-二硝基联苯,CQDs对此有一定缓解;腐殖酸可促进CQDs调控希瓦氏菌MR-1还原2,2’-二硝基联苯的反应.

希瓦氏菌群体感应调控的综合实验

设计了以水产腐败菌群体感应系统为靶点的新型防治策略实验,探究了群体感应淬灭酶AiiA酶对希瓦氏菌群体感应窃听的调控及对其生长、生物膜和蛋白酶的影响。对于希瓦氏菌与沙雷氏菌的共培养体系以及外源C6-HSL和O-C6-HSL信号分子模拟的窃听体系,AiiA酶均可阻断希瓦氏菌窃听信号分子从而影响其自身代谢。依托科研实验室资源,融合科技前沿知识,结合基因工程、酶工程、食品贮藏原理等专业实验教学,具有综合性、创新性特点,有助于培养学生学习兴趣、知识融汇贯通能力、探索精神及动手操作技能。

脱色希瓦氏菌（Shewanella decolorationis）S12^T的脱色特性

从印染废水活性污泥中分离到一株高效染料脱色菌,经鉴定该菌株为希瓦氏菌属的一个新种,命名为脱色希瓦氏菌(Shewanelladecolorationis)S12T。该菌株在偶氮染料浓度为50mg/L的培养基中培养4h后,染料去除率达到96%,对偶氮染料的最高脱色浓度达到2000mg/L。在浓度为500mg/L的偶氮染料平板上生长4d后,可观察到明显的脱色圈。全波长光谱扫描的结果表明希瓦氏菌S12T以生物降解的方式对偶氮染料进行脱色。希瓦氏菌S12T的脱色酶为组成型的胞内酶。

海水希瓦氏菌(Shewanella aquimarina)PCR检测方法

海水希瓦氏菌(Shewanella aquimarina)是虾夷马粪海胆的一种致病菌。为建立海水希瓦氏菌PCR快速检测方法,根据海水希瓦氏菌gyrB基因的高变区序列设计3对引物,随后进行了其特异性和灵敏度分析。结果显示引物SA-9可扩增出片段大小为815 bp的海水希瓦氏菌特异片段。引物可检测的最低细菌量为4.6×103cfu/mL,最低DNA含量为3.15×10-4ng/μL。表明以SA-9为引物的PCR检测方法特异性强,灵敏度高。另外以该方法对海胆及其生境样品进行初步检测,发现健康海胆、养殖海水及投喂海带为阴性,而自然海域的海水具有一定量的海水希瓦氏菌。

低浓度微酸性电解水对纯培养及海虾中副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的杀灭作用

为探究低浓度微酸性电解水(low concentration slightly acidic electrolyzed water,LcSAEW)对纯培养及海虾中的副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的杀灭作用,该研究通过平板计数、生长曲线、电导率、膜电位、胞内物质渗漏量、活性氧和显微镜观察分析了LcSAEW对两种细菌的抑菌效果、细胞膜完整性以及细胞形态的影响。结果表明,有效氯浓度为4、8 mg/L的LcSAEW处理纯培养副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌30 s时,菌落数均降低8 lg CFU/mL以上。用10 mg/L的LcSAEW处理接种两种目标菌的海虾10 min后,菌落数分别降低1.6、1.25 lg CFU/mL。LcSAEW处理后,2种细菌的代谢活性和胞内ATP浓度均降低,而电导率、胞外DNA、蛋白质和K^(+)含量均上升。此外,膜电位呈现超极化,胞内活性氧累积,细胞形态出现凹陷、皱缩现象。综上所述,LcSAEW可以破坏细胞结构、细胞膜通透性,导致细菌活性紊乱甚至凋亡。该研究可为LcSAEW在水产品中的应用提供理论依据。

3种多酚对腐败希瓦氏菌的抑菌效果和机理

为探讨葡萄籽提取物(grape seed extract,GSE)、莲房原花青素(lotus seed proanthocyanidins,LSPC)和莲藕多酚提取物(lotus root polyphenol extract,LRPE)3种植物多酚对腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的抑菌机理。通过最小抑菌质量浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)、生长曲线探究3种多酚对腐败希瓦氏菌的抑菌效果,并通过扫描电子显微镜观察、相对电导率测定、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色观察及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活力、胞外蛋白含量、核酸泄漏、Na^(+)K^(+)-ATP酶活性及膜蛋白荧光等测定,探讨3种多酚的抑菌机理。结果表明:GSE、LRPE、LSPC对腐败希瓦氏菌的MIC分别为31.25、62.25、125.00μg/mL;菌体经3种植物多酚处理后,膜蛋白位置发生改变,荧光强度降低,菌体形态发生改变,表面出现凹陷皱缩,且生长明显被抑制,胞外AKP活力、菌悬液中核酸、胞外蛋白含量、相对电导率及PI摄入量显著增加,Na^(+)K^(+)-ATP酶发生一定程度地失活,导致细胞死亡。

腐败希瓦氏菌的适冷机制研究进展

水产品在低温冷藏保存过程中会受低温特定优势腐败菌的污染而生成刺激性气味的代谢产物,感官发生不良变化,严重影响着冷链食品安全,其中腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是多种水产品的特定腐败菌之一。本文通过分析腐败希瓦氏菌适冷性质与脂质、细胞膜、酶等因素之间的关系,阐述了腐败希瓦氏菌通过对脂肪酸代谢途径和细胞膜成分的改变,调节和维持细菌在低温下基本细胞膜流动性和物质交换能力,降低胞外环境的胁迫压力,并且发现胞外生物膜的形成会增强腐败希瓦氏菌冷适应能力。此外,甘油磷脂、溶血磷脂和相关酶等生物活性大分子调节合成和代谢途径能够影响腐败希瓦氏菌在低温下冷适应生长过程。转录组学研究也详细揭示了细菌通过代谢调节来维持其冷适应能力。因此,本文综述了腐败希瓦氏菌多种适冷调控机制,以期为保障水产品质量和安全提供新的思路。

热超声处理对腐败希瓦氏菌可活不可培养状态的影响

【目的】研究水产品中常见的腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)在热超声处理下进入可活不可培养(VBNC)状态的生理特性以及复苏状况。【方法】以腐败希瓦氏菌为研究对象,首先采用平板计数法测定腐败希瓦氏菌在不同温度(35、40、45、50、55、60、65、70℃)和不同功率(100、150、200、250、300 W)热超声处理下的细菌。进而在70℃、不同功率(100、150、200、250、300 W)TS条件下处理腐败希瓦氏菌,利用流式细胞学技术对不同状态的细菌群体进行计数,通过台盼蓝染色验证其存活状态,结合透射电子显微镜观察其形态变化,并使用DNA体外扩增技术检测其VBNC状态特征。最后,将经过70℃、300 W条件TS处理的菌株进行复苏实验。【结果】腐败希瓦氏菌经不同条件的热超声处理后,其细菌死亡率同温度和超声功率成正相关。流式细胞学技术和台盼蓝染色结果表明,在高热超声处理(50 kHz、300 W、超声处理30 min以及70℃加热)下的细菌会大量死亡,但仍有5.87%菌体存活,结合平板计数结果,表明这部分细菌已进入VBNC状态。透射电镜显微镜观察发现,VBNC菌体存在细胞壁和细胞膜变厚,细胞质密度增加,核区模糊的情况。体外扩增结果表明,热超声处理会降解细菌DNA,且复苏实验证明热超声处理后VBNC状态的腐败希瓦氏菌仍存在复苏能力。【结论】在300 W以及70℃加热的热超声处理下会诱导腐败希瓦氏菌进入VBNC状态,处于该状态下的菌体会对TS处理产生一系列生理特性的改变来抵抗外界环境,且当处于适宜环境下时,VBNC状态下的腐败希瓦氏菌会复苏并继续生长增殖。即使经过严格处理过程,仍需对食品安全中的VBNC细菌进行全面监控。

腐败希瓦氏菌4H铬还原机制的探究

本文为探究腐败希瓦氏菌4H还原Cr(Ⅵ)的机制,采用扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)、电化学测试等方法进行表征。结果表明腐败希瓦氏菌4H还原Cr(Ⅵ)的机制主要与微生物的代谢和电子传递能力有关。通过XPS分析发现细菌在对Cr(Ⅵ)的还原过程中,菌体表面有Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)两种形态存在,进一步证明该菌通过还原方法去除六价铬;扫描电镜结果显示,在六价铬胁迫下细菌表面无明显破损,菌体形态由短杆型变成了长杆型,说明该菌对Cr(Ⅵ)具有很强的耐受性;傅里叶红外光谱结果显示随着初始Cr(Ⅵ)浓度的增加,羟基、羧基、酰胺和磷酸基团所代表的特征峰强度也有明显的增强;细菌电子传递性能测试以及电化学测试结果显示该菌具有很强的电子传递能力。本文通过对腐败希瓦氏菌4H还原Cr(Ⅵ)的机制的探究为微生物还原环境中Cr(Ⅵ)提供了理论基础。

海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)发酵培养基条件优化的研究

目的:优化海藻希瓦氏菌生产河豚毒素的发酵培养基。方法:通过测定菌体密度(用OD600表示)和菌体收获量,研究了部分初始条件及添加不同营养物质对海藻希瓦氏菌生长的影响,采用单因素试验和正交试验对发酵条件进行了优化。结果:最适发酵初始pH为7.5,最适摇瓶装液量为150mL。通过正交试验找出最大影响因素为葡萄糖供应,优化后的培养基最佳配方为:在2216E培养基中添加1.0%葡萄糖、2.5%酵母粉、1.0%磷酸高铁。结论:优化后的培养基培养供试菌,菌体收获量比在2216E培养基中培养增加了2.012g.L-1。

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)二十碳五烯酸生物合成基因簇的钓取及鉴定

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)是从海洋动物肠道分离得到的1株产二十碳五烯酸(Ecicosapentaenoic acid,EPA)的海洋细菌。利用PCR方法、Overlap PCR及Gibson Assemble技术克隆该菌中包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD的EPA生物合成基因簇,全长18.4 kb。序列分析表明所钓取的合成基因簇与来自希瓦氏菌SCRC-2738的EPA合成基因簇有88%的相似度,均编码聚酮合酶。以构建的低拷贝表达载体pACYC-Trc为骨架,通过Gibson Assemble技术构建EPA基因簇表达质粒pLYSCY03。钓取大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)细胞中的entD基因,克隆至表达载体pTrc99a中,构建成为重组质粒pLYSCY01。将两个表达质粒同时导入大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中,获得产EPA的工程菌株。结果表明,希瓦氏菌中含有EPA聚酮生物合成基因簇,大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中的entD基因可以替代pfaE基因与钓取的EPA合成基因协同合成EPA。

希瓦氏菌Shewanella sp.MR-4在不同末端电子受体条件下的代谢通量分析

本研究解析了Shewanella sp.MR-4在厌氧条件下以Fe^(3+)、延胡索酸、硝酸和二甲基亚砜(DMSO)为末端电子受体时代谢通量分布,发现在各种不同末端电子受体条件下细胞内代谢通量分布发生显著改变。与延胡索酸相比,在Fe^(3+)和硝酸为电子受体条件下,乙酸生成速率明显降低,而三羧酸循环代谢通量增加。同时,三羧酸循环回补反应存在显著差异:在延胡索酸为电子受体条件下,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶反应是唯一回补反应,而在Fe^(3+)和硝酸条件下苹果酸酶催化成为唯一回补反应。本研究在代谢通量分析基础上定量解析了还原力NADH合成和消耗,分析了电子流向变化,发现在不同末端电子受体条件下,NADH产生途径和反应发生明显变化。研究结果为希瓦氏菌代谢工程改造提供了一定理论依据。

一个降解染料的希瓦氏菌新种——中国希瓦氏菌

从细胞形态、生理生化特性和 16SrRNA基因和gyrB基因序列同源性分析等方面对一株广谱高效染料降解菌D14进行了鉴定。菌株D14的细胞壁革兰氏染色为阴性 ,细胞为杆状 ,大小为 0 6 μm～ 1 0 μm× 1 0 μm～ 4 0 μm ,周身纤毛 ,极生单鞭毛 ,其生长pH范围为pH 7 0～ 10 0 ,最适生长pH为 8 0 ,生长温度范围为 4℃～ 4 0℃ ,最适生长温度为 2 0℃～ 30℃。该菌株具有还原三价铁 ,液化明胶、Tween 4 0和Tween 80 ,产生H2 S的能力。在乳酸钠存在的条件下 ,能还原硝酸盐、亚硝酸盐、铁氧化物和硫代硫酸钠。可利用D_半乳糖、D_葡萄糖、蔗糖、丙酸钠、L_亮氨酸等多种有机物为碳源。BIOLOG细菌自动鉴定系统鉴定结果表明该菌株应归属于希瓦菌属。 16SrDNA和gyrB基因序列分析结果表明 ,菌株D14与其亲缘关系最近的菌株ShewanellaputrefacienATCC80 71T的 16SrDNA序列相似值为97% (小于 97 7% ) ,gyrB基因序列相似值为 87% (小于 90 % )。菌体所含有的主要脂肪酸为iso_15 :0 ,16 :1ω7c ,15 :0和 16 :0 ,DNA中 (G +C)mol%含量为 4 9 3。结合菌株D14的生理生化特征和分子生物学特性 ,将菌株定为希瓦氏菌属的一个新种 ,命名为中国希瓦氏菌 (Shewanellacinica)D14 T。

茶多酚抑制腐败希瓦氏菌机理研究

研究评价了茶多酚对腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的抑菌和杀菌效果,并初步探讨了其抑菌机理。结果表明,茶多酚对腐败希瓦氏菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为1 mg·mL-1和16 mg·mL-1,2 mg·mL-1茶多酚处理能显著抑制细菌的生长曲线,在25℃和4℃作用96 h和192 h希瓦氏菌分别下降了105 CFU·mL-1和106 CFU·mL-1,杀菌作用表现时间依赖性。茶多酚单体的杀菌能力大小分别为EGCG>ECG>EGC>EC。在茶多酚作用下,腐败希瓦氏菌胞外上清中Na+/K+-ATP酶和AKP酶活性显著上升,投射电镜(TEM)观察细菌出现了破损、变形等现象。可见,茶多酚能有效抑制腐败希瓦氏菌的生长,在低温长时间下仍表现出杀菌能力,其杀菌机制主要是引起细菌细胞壁和细胞外膜损伤,使胞内成分泄漏,导致细菌死亡。

植酸对腐败希瓦氏菌的抑菌机理

结合植酸对南美白对虾的保鲜,以虾体优势腐败菌-腐败希瓦氏菌为研究对象,利用植酸溶液处理后,通过对细菌的抑菌效果及最小抑菌浓度、细菌生长曲线、碱性磷酸酶(AKP)等的测定研究其抑菌机理。结果表明,植酸对腐败希瓦氏菌有较强的抑菌效果,最低抑菌浓度(体积分数)为0.2%。同对照组相比,植酸能够影响细菌的生长规律,使细胞破损。细胞壁和细胞膜遭到破坏,AKP及电导率均增大,初步阐述了植酸对腐败希瓦氏菌的抑菌机理。

厌氧条件下希瓦氏菌腐殖质还原对偶氮还原的影响

以希瓦氏菌属的3个代表种为研究对象，研究了在厌氧条件下腐殖质的存在对偶氮还原的影响。实验结果表明：3个代表菌株在厌氧条件下都有高效的偶氮还原和腐殖质还原功能，1mmol／L偶氮染料在24h内完全脱色，并且偶氮还原与电子供体氧化存在着紧密的偶联关系。腐殖质物质模式物2-磺酸蒽醌AQS在小于1。2mmol／L条件下能显著加速偶氮还原，12h就完全脱色，3mmol／L时18h完全脱色。但当浓度大于3mmol／L时则对偶氮还原产生明显抑制作用。另一腐殖质模式物2，6-双磺酸蒽醌AQDS其浓度在1—3mmol／L以内亦使脱色在12h内完成，4—6mmol／L时15h左右完成脱色。7—12mmol／L仍有一定的脱色促进作用，但随着浓度的提高，其促进作用也逐渐减弱。这说明腐殖质的确可以作为氧化还原中间体穿梭于电子供体与染料的偶氮双键之间促进偶氮还原。但当其浓度达到某一阈值时它就显出与偶氮键竞争电子的本质，从而使偶氮还原速率下降。原因在于他们的氧化还原电势的差异，导致细菌呼吸链的电子递体对腐殖质物质和偶氮键的亲和力不同，从而使不同腐殖质浓度对偶氮键还原产生了不同的影响。

复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理

为了研究复合生物保鲜剂对冷藏带鱼优势腐败菌(腐败希瓦氏菌)的抑菌作用机理,通过牛津杯法测定了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并测定了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌活力、细菌生长曲线、细胞膜完整性和细胞的稳定性,对细菌超微结构进行了观察。结果显示:复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的MIC与MBC分别为1.6 mg/ml与3.3 mg/ml,且随着作用时间的延长,复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的生长有明显抑制作用;尤其经2倍最小杀菌浓度的复合生物保鲜剂处理后,细菌未出现对数生长期;菌液在260 nm处的吸光值明显升高,菌体细胞膜完整性受到破坏;菌体细胞中的碱性磷酸酶升高,菌体细胞壁通透性增大;菌悬液的电导率值明显增大,细胞膜稳定性受损。细菌超微结构观察发现,复合生物保鲜剂作用于菌体细胞后,菌体细胞开始出现皱缩、扭曲变形、表面粗糙和布满泡状物及细胞壁塌陷等现象。表明复合生物保鲜剂可以破坏细菌的细胞内环境和细胞膜稳定性,影响了细菌的正常生长;并且通过影响细菌对营养物质的吸收和代谢物的排出,最终导致菌体死亡。

希瓦氏菌在印染废水脱色中的研究进展

印染废水是一种常见的工业废水,已经成为最主要的水体污染源之一。目前利用微生物处理印染废水的研究取得了许多重要进展,其中金属还原菌希瓦氏菌(Shewanella sp.)对多种染料具有很好的脱色效果。文章结合当前的研究进展,综述了希瓦氏菌对多种染料的脱色效果,脱色的机制及影响其染料脱色效果的因素,并提出了今后研究的热点问题。

中国希瓦氏菌D14^T的厌氧腐殖质呼吸

实验证明,希瓦氏菌新种(ShewanellacinicaD14T)在厌氧条件下可以利用多种有机酸盐和甲苯等环境有毒污染物作为电子供体,以腐殖质作为唯一末端电子受体进行厌氧呼吸(即醌呼吸)。电子在细胞膜呼吸链的传递过程中,偶联能量的产生来支持菌体的生长,1mmol/LAQDS可支持细胞增殖约60倍。电子供体的氧化和唯一电子受体腐殖质还原之间存在着动态的偶联过程,随着电子供体量的增加腐殖质还原的量也随之增加。典型呼吸链抑制剂诸如:抑制Fe-S中心的Cu2+,甲基萘醌类似物标桩菌素,抑制甲基萘醌氧化型向还原型转化的双香豆素和细胞色素P450的专一抑制物甲吡酮等对腐殖质的还原有着极为显著的抑制作用,为进一步证明希瓦氏菌(Shewanellacinica)D14T可利用腐殖质进行厌氧呼吸提供了有力的佐证。而D14T在进行腐殖质呼吸的同时,对于甲苯,苯胺等环境有毒物质的有效降解则具有着重要的环境学意义。