中国帕利亚姆血清群中山病毒的分离及全基因组序列分析

旨在获取中国帕利亚姆血清群中山病毒(Chuzan virus, CHUV)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。应用BHK-21、Vero、MDBK细胞对云南省江城县采集的152份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,针对出现细胞病变样品,采用CHUV VP7蛋白基因片段进行RT-PCR扩增和测序,并对阳性样品进行全长扩增及高通量测序,获得的全基因组序列进行遗传进化分析。结果:1份血液样品可致BHK 21、Vero、MDBK细胞病变;病毒基因组为10节段的“3-3-3-1”带型;病毒基因全长18 914 bp,各基因节段长度在728 bp(Seg-10)~3 930 bp(Seg-1)之间,编码6 072个氨基酸残基,编码蛋白在211(NS3蛋白)~1 295(VP1蛋白)个氨基酸残基之间;通过对保守基因Seg-1,Seg-3、Seg-7的核苷酸系统发育分析,显示与中国本土CHUV亲缘关系最近,为98.17%~99.65%,形成一簇;变异基因Seg-2的核苷酸序列同样与中国本土CHUV毒株相似度最近,为98.76%~99.57%。本研究表明中国CHUV毒株的Seg-1、Seg-3和Seg-7形成了独特的地域型,为深入揭示我国CHUV的致病性和病原学特征提供了基础数据。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

【目的】建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。【方法】选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。【结果】三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。【结论】本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。

2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析

旨在从牛、羊监控动物群中,对流行于我国的帕利亚姆血清群病毒(PALV)进行分离、鉴定与序列特征分析,明确我国流行毒株与国外毒株之间的关系。自监控动物采集的PALV阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;对所分离PALV毒株的Seg-7与Seg-2基因节段进行扩增、测序与序列分析;通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳分析不同血清型PALV代表毒株基因组的"电泳带型"特征;通过免疫荧光与中和试验分析不同血清型PALV的阳性血清之间的交叉反应特性与中和活性。试验结果如下:2012—2016年,在云南、广西、广东共计分离出19株PALV;Seg-2与Seg-7测序与系统发育分析显示,分离毒株分属Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)与Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型,不同血清型毒株均与日本毒株具有最近的亲缘关系,而与澳洲、非洲毒株亲缘关系较远。病毒基因组电泳结果显示PALV基因组呈现"3-3-4"的电泳带型特征。免疫荧光结果显示针对CHUV的多克隆抗体可使感染CHUV、DAV与BCV的BHK-21细胞呈现特异性荧光。血清学中和试验显示,CHUV、DAV与BCV三种病毒的阳性血清之间无交叉中和保护作用。本研究报道了2012—2016年中国PALV的分离与Seg-2、Seg-7序列特征,并首次报道了PALV的DAV与BCV两种血清型病毒在我国的分离,研究结果将有助于掌握我国PALV的分布与遗传特征,为诊断试剂的开发、流行病学调查与致病性研究提供科学依据。

帕利亚姆血清群病毒一步法RT-PCR检测技术的建立

帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-7保守基因序列,设计针对PALV的群特异性RT-PCR扩增引物,通过反应条件优化,建立了PALV的一步法RT-PCR检测方法,其最佳引物浓度为0.8μmol/L;最佳退火温度为56℃。对该方法进行特异性试验,结果显示该方法可特异性的检测出CHUV、BCV和DAV核酸,而对环状病毒属的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒和广西环状病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对RNA标准品的最低检测限为6.9×10~1拷贝/μL。利用该方法检测血液样品,结果显示该方法检测结果与病毒分离结果基本一致。本研究建立的PALV一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高等优点,为开展PALV感染疫病诊断与流行病学研究提供了技术保障。

云南景洪帕利亚姆亚群达圭勒病毒的分离与鉴定

为了解牛感染帕利亚姆亚群达圭勒病毒(D’Aguilar virus,DAGV)情况,本研究应用BHK21细胞对2019年云南省景洪市采集的健康黄牛血液样品进行盲传病毒分离,对出现细胞病变的样品进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S2、S3、S7基因序列测定和比对分析。结果显示,有5个血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察到完整病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳结果发现5株新分离病毒基因组为10节段,呈现3-3-4的电泳带型特征,其带型特征与2014年在云南分离到的DAGV V106/YN/2014毒株相似;5株病毒S2、S3、S7基因核苷酸、氨基酸序列相似性均为100%,S3、S7片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的帕利亚姆亚群病毒(Palyamserogroup virus,PALV)毒株相似性最高;S2片段氨基酸与核苷酸序列与日本分离的DAGV相似性最高。S2、S3、S7基因遗传进化分析结果显示,5株新分离毒株间基因相似度为100%;5个毒株的S7与S3基因序列均与中国本土分离的已知部分PALV毒株在同一分支,亲缘关系较近,提示这5株毒株为PALV;5株毒株S2片段核苷酸序列与日本分离的部分DAGV毒株位于同一分支上,亲缘关系较近,进一步证实这5株毒株为PALV DAGV。本研究成功分离到5株DAGV毒株,并进行了基因片段遗传进化分析,为进一步开展DAGV流行病学研究提供基础。

帕利亚姆血清群病毒qRT-PCR检测方法的建立与应用

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)具有多种血清型,可引起感染的妊娠家畜出现生产异常,在我国呈广泛流行的趋势,但目前尚无该病毒的高通量快速检测技术。本研究旨在建立PALV的高通量逆转录实时荧光定量(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测方法用于临床样本中病毒的检测。采用一步法RT-PCR对我国流行的PALV代表毒株的基因节段7(Seg-7)进行全长序列测定,根据Seg-7高度保守的区域合成特异性PCR引物与TaqMan探针,建立PALV的qRT-PCR检测方法;以体外转录PALV的Seg-7 ssRNA为模板,分析qRT-PCR检测方法的特异性、敏感性与重复性;以我国不同血清型的PALV分离毒株及血液样本为检测对象,分析qRT-PCR检测方法的实际检测效果。测序结果显示我国流行的不同血清型PALV毒株Seg-7序列高度保守,且与日本毒株的核酸序列相似度为99.59%~99.80%。建立的PALV群特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性与准确性:可检测PALV最低核酸拷贝数为23拷贝,与蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒、西藏环状病毒、云南环状病毒、广西环状病毒、牛流行热病毒以及阿卡斑病毒之间无交叉反应;对我国不同血清型的PALV分离毒株及分离病毒的血液样本的检测结果吻合率达到100%。对120份临床血液样本进行PALV核酸与抗体检测结果显示:qRT-PCR检测阳性率为35%,而抗体C-ELISA检测阳性率为30%,二者吻合率为85.7%。本研究提示PALV的Seg-7序列高度保守,可作为病毒核酸检测的靶基因。本研究所建立的PALV群特异性qRT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可靠性好的优势,为开展PALV诊断与流行病学监测提供了新的技术手段。

帕利亚姆病毒血清型特异性RT-PCR检测方法的建立

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)包含多种血清型病毒,我国存在Chuzan virus(CHUV)、Bunyip Creek virus (BCV)和D’Aguilar virus (DAV)三种血清型PALV毒株的流行,目前尚无PALV血清型特异性RT-PCR检测方法的报道。本研究根据获取的中国CHUV、BAV和DAV这三种PALV血清型毒株的Seg-2序列,设计合成了3对特异性引物,建立了PALV血清型特异性一步法RT-PCR检测方法。灵敏度试验结果显示,CHUV、BCV和DAV血清型鉴定引物可分别检测到1.3×10^2 copies、8.0×10^2 copies和5.5×10^2 copies的核酸;特异性试验结果表明,本研究建立的PALV血清型特异性检测方法与蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、非洲马瘟病毒(ASHV)均无交叉反应。本研究建立的PALV血清型特异性RT-PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,为开展PALV的诊断与流行病学监测提供了有效的技术手段。

2019年云南省景洪市哨兵动物多种虫媒病毒的分离鉴定

本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV),2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV),1株帕利亚血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)中的D’Aguilar virus(DAV)血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。

云南省PALV的分离鉴定及序列特征分析

为掌握云南地区帕利亚姆血清群病毒(PALV)的分布情况和遗传特性,本研究分别在云南省师宗、江城及芒市设立监控点,通过定期采集哨兵动物抗凝血以“C6/36细胞-BHK细胞”的接种方式分离病毒,通过提取病毒RNA进行RT-PCR以鉴定病毒血清型,通过设计特异性引物对分离株Seg-2、Seg-3、Seg-7进行克隆及测序比对以分析其遗传特性。结果显示,从2017年云南省师宗县样品中获得5株阳性分离物,其中Chuzan virus(CHUV)2株,D’Aguilar virus(DAV)1株,Bluetongue virus(BTV)2株,经病毒序列结果比对和进化分析,2株CHUV的Seg-2和Seg-3与中国分离株独立成一簇,体现出明显的地域性,而2株CHUV的Seg-7相似度>99%,与云南、广西、台湾PALV具有相近的亲缘关系。分离株DAV的Seg-2独立成为一支,与非洲毒株亲缘关系最近,其Seg-3和Seg-7则相对保守,3株PALV分离株的Seg-3在系统发生树上划分为“东方型”地域型。研究结果为进一步开展PALV的感染特性、流行病学与疫苗研究奠定基础。