改进的PCR法克隆带小棒链霉菌cefD基因

以 GC含量高达 74%的带小棒链霉菌 ( S.clavuligerus)染色体 DNA为模板 ,从引物设计、退火温度、有机辅剂及 DNA聚合酶等方面改善 PCR反应体系和扩增条件 ,成功地克隆得到了异青霉素异构酶的 cef D基因。改进后的 PCR体系中 φDMSO=0 .0 5并加入适量的 Taq DNA聚合酶 ,退火温度比常规选择高一些 ,从而克服了常规 PCR法扩增链霉菌基因遇到的二级结构复杂、引物与模板难以配对及引物间和引物内部易形成碱基配对等问题。改进后的 PCR法提高了链霉菌基因克隆的效率 ,也可以广泛应用于高

产黄青霉penDE基因的克隆及其在带小棒链霉菌中的表达

penDE基因编码40k的酰基-CoA:6-APA酰基转移酶(IAT),可催化产黄青霉中青霉素生物合成途径的最后一步酶反应。利用RT-PCR法从产黄青霉中扩增得1.1kbp的不含内含子的penDE基因,并将其克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pUWL201,使penDE基因位于ermEp*启动子的下游,再将其转化带小棒链霉菌,获得了能够表达IAT的转化子。PDAB法和抗菌活性测定表明,所表达的IAT蛋白对6-氨基青霉烷酸和苯乙酰CoA有明显的活性。