小窝蛋白-1对N-甲基-D天冬氨酸诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1的破坏作用研究

目的:探索小窝蛋白(Cav)-1对N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO-1)和血脑屏障完整性的破坏作用。方法:体外培养人脑微血管内皮细胞HBEC-5i并构建血脑屏障模型。以不同浓度的NMDA孵育HBEC-5i,并观察其对细胞活力的影响。细胞分别用NMDA受体(NMDAR)拮抗剂MK-801或Cav-1抑制剂Daidzein预处理后再用NMDA孵育。蛋白免疫印记(western blotting)法检测ZO-1、Cav-1及p-Cav-1蛋白的表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测ZO-1 mRNA的表达;跨膜细胞电阻仪Millicell ERS Volt-Ohm meter测量血脑屏障模型跨内皮细胞膜电阻(TEER)值。结果:与对照组比较,NMDA组p-Cav-1蛋白表达升高(P<0.05),ZO-1蛋白和mRNA表达下降(P<0.01),同时TEER值下降(P<0.001)。与NMDA组比较,使用MK801拮抗NMDAR活化后ZO-1蛋白和mRNA水平上调(P<0.05),TEER值增加(P<0.001);用Daidzein抑制Cav-1活化可下调p-Cav-1蛋白表达(P<0.05),上调ZO-1蛋白和mRNA表达(P<0.05)以及增加TEER(P<0.001)。结论:NMDA可诱导HBEC-5i中紧密连接蛋白ZO-1的破坏,从而增加紧密连接屏障的通透性。抑制Cav-1的活化可阻断NMDA诱导的ZO-1表达下降和减少TEER。

缺氧条件下人肠上皮细胞丝切蛋白活化及其与带状闭合蛋白1分布的关系

目的研究缺氧对肠上皮细胞丝切蛋白活化的影响及丝切蛋白活化与紧密连接蛋白带状闭合蛋白（ZO－1）分布变化的关系。方法建立人肠上皮细胞株Caeo－2单层细胞培养模型，取部分细胞按照随机数字表法分为对照组（不处理）、缺氧组（置于缺氧环境下）和常氧组（置于常氧环境下），取对照组细胞（样小数为9）及其他2组培养1、2、6、12、24h的细胞（各时相点样本数均为9）采用蛋白质印迹法检测丝切蛋白及磷酸化丝切蛋白的表达。另取细胞，按照随机数字表法分为缺氧组和对照组（处理同前），取对照组细胞和缺氧组缺氧1、2、6、12、24h的细胞采用激光扫描共聚焦显微镜观察纤维状肌动蛋白的形态与分布，荧光法检测纤维状肌动蛋白与球状肌动蛋白含量的比值，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态及ZO－1的分布；该3个实验中对照组样本数依次为3、6、3，缺氧组各时相点样本数依次为3、6、3。对数据行重复测量方差分析、配对t检验、LSD-t检验。结果与对照组比较，常氧组细胞培养1～24h丝切蛋白发磷酸化丝切蛋白表达量均无明显变化（t值分别为－0．385～1．701、0．040～1．538，P值均大于0．05）。与对照组比较，缺氧纰细胞培养1～24h丝切蛋白表达量也无明显变化（t值为1．032～2．390，P值均大于0．05）；但磷酸化丝切蛋白表达量均明显降低（t值为4．563～22．678，P值均小于0．01），其中培养24h降至最低值。常氧组、缺氧组细胞各时相点丝切蛋白表达量相近（t值为－0．904～1．433，P值均大于0．05）；缺氧组细胞培养l、2、6、12、24h时磷酸化丝切蛋白表达量分别为0．87±0．08、0．78±0．05、0．89±0．07、0．68±0．07、0．57±0．06，均低于常氧绀（0．90±0．07、0．97±0．06、1．00±0．06、1．00±0．05、0．99±0．05，t值为3．193～16．434，P值均小于0．01）。对照组细胞胞质内纤维状肌动蛋白丰富，大多呈束状；缺氧组细胞从缺氧1h起纤维状肌动蛋白走向混乱、长度变短甚至消散。缺氧组细胞缺氧12、24h时纤维状肌动蛋白与球状肌动蛋白含量比值分别为0．89±0．12、0．84±0．19，均明显低于对照组（1．00，t值分别为3．622、3．577，P值均小于0．01）；其余时相点两者的比值与对照组接近（t值为0．447～1．526，P值均大于0．05）。对照组细胞排列紧密，ZO－1沿细胞膜连续分布；缺氧组从缺氧2h起细胞形态不规则，其中缺铽24h时ZO－1沿细胞膜分布不再连续，出现断裂。结论缺氧可能通过诱导肠上皮细胞丝切蛋白活化，引起纤维状肌动蛋白与球状肌动蛋白动态平衡失调，从而导致紧密连接蛋白ZO－1分布发生改变。

清化肠饮对结肠炎相关结直肠癌小鼠及其肠道屏障功能的影响

目的观察清化肠饮对结肠炎相关结直肠癌(colitis-associated colorectal cancer,CAC)小鼠及其肠道屏障功能的影响。方法将40只C57BL/6小鼠随机均分为空白组、模型组、清化肠饮组、阳性对照组。除空白组外,其余组均用氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)联合诱导建立CAC小鼠模型,清化肠饮组给予清化肠饮灌胃剂量为1.8 g/(kg·d);阳性对照组给予柳氮磺吡啶混悬液0.45 g/(kg·d);空白组给予等量无菌生理盐水灌胃。均干预8周。观察并记录小鼠一般情况、体质量、疾病活动指数(disease activity index,DAI)及肿瘤长度;采用HE染色法观察小鼠结直肠组织病理变化;采用Western blot法检测小鼠结直肠组织中闭合蛋白-1(Claudin-1)、咬合蛋白(Occludin)、带状闭合蛋白-1(ZO-1)蛋白表达水平。结果模型组出现便血、脱肛等情况。与空白组相比,模型组、清化肠饮组、阳性对照组小鼠DAI评分明显升高(P<0.05或P<0.01)。与空白组相比,模型组、清化肠饮组、阳性对照组小鼠结直肠长度均缩短(P<0.01或P<0.05);与模型组比较,清化肠饮组与阳性对照组结直肠长度增长(P<0.01)。HE病理结果显示,模型组腺体高级别管状腺瘤形成,清化肠饮组存在低级别腺瘤和高级别瘤变。与空白组相比,模型组小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1蛋白表达升高(P<0.01),Occludin、ZO-1蛋白表达水平降低(P<0.01);与模型组相比,清化肠饮组、阳性对照组Claudin-1蛋白表达水平降低(P<0.01),清化肠饮组、阳性对照组Occludin、ZO-1蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01)。与清化肠饮组相比,阳性对照组Claudin-1蛋白表达水平降低(P<0.01),Occludin、ZO-1蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论清化肠饮可抑制CAC,其机制可能与改善肠道炎症反应、调节肠道屏障功能相关。

小牛血清去蛋白对脑缺血-再灌注损伤模型大鼠血脑屏障的保护作用研究

目的探讨小牛血清去蛋白对脑缺血-再灌注损伤模型大鼠血脑屏障(BBB)的保护作用。方法将100只SD大鼠随机分为假手术组(A组,等体积0. 9%氯化钠溶液)、模型组(B组,等体积0. 9%氯化钠溶液)及小牛血清去蛋白低剂量组(C_1组,7. 5 mg/kg,按肽量计,下同)和高剂量组(C_2组,37. 5 mg/kg),灌胃给药,每天1次,连续10 d。以栓线法建立脑缺血-再灌注损伤模型。在脑缺血-再灌注24 h时测定大鼠缺血区脑组织伊文斯蓝(EB)含量,采用免疫组化法检测大鼠BBB带状闭合蛋白-1(ZO-1)表达水平,以光镜、电镜观察大鼠BBB超微结构,以硝酸镧示踪电镜观察大鼠脑缺血-再灌注48 h时BBB的通透性。结果与A组比较,B组大鼠缺血区脑组织EB含量显著增加,ZO-1阳性血管数显著减少(P <0. 05);大鼠脑间质及神经纤维肿胀,内皮细胞皱缩。再灌注0. 5 h时,内皮细胞间紧密连接处(TJ)可见镧颗粒; 2～6 h时,内皮细胞空泡变多,足突和基底膜分离; 12～24 h时,神经细胞出现变性、坏死、核溶解,基底膜变得不连续; 48 h时,神经细胞坏死数量明显增多,内皮细胞的完整性也逐渐受到破坏。与B组比较,C_1组和C_2组大鼠脑组织EB含量显著减少,C_2组ZO-1阳性血管数显著增加(P <0. 05); C_1组和C_2组大鼠BBB受损程度有所减轻。结论小牛血清去蛋白对脑缺血-再灌注损伤模型大鼠BBB有保护作用,其机制可能与稳定缺血区脑细胞和增强ZO-1表达有关。

晚期糖基化终产物诱导内皮细胞紧密连接改变及其机制

目的探讨晚期糖基化终产物修饰蛋白对内皮细胞紧密连接带状闭合蛋白1的形态学影响,并对其机制作初步研究。方法培养人脐静脉内皮细胞,用免疫荧光染色方法显示带状闭合蛋白1在内皮细胞分布的形态和部位。观察不同浓度和不同时间晚期糖基化终产物修饰蛋白作用下内皮细胞带状闭合蛋白1的形态学变化。研究了细胞外信号调节激酶、p38丝裂原活化蛋白激酶通路抑制剂及相关特异蛋白突变体重组腺病毒转染对晚期糖基化终产物介导的内皮细胞闭合蛋白1形态学变化的影响。结果正常对照组的内皮细胞闭合蛋白1存在于细胞周边呈环状,线条清晰连续,边缘光滑流畅,晚期糖基化终产物以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞紧密连接带状闭合蛋白1结构形态的改变;细胞外信号调节激酶通路抑制剂或p38丝裂原活化蛋白激酶通路抑制剂均可减轻晚期糖基化终产物对闭合蛋白1的影响;转染显性失活的细胞外信号调节激酶上游激酶MEK1和p38丝裂原活化蛋白激酶上游激酶MEK6b的重组腺病毒,均可减轻晚期糖基化终产物对带状闭合蛋白1形态的影响,而转染组成性激活的MEK1和MEK6b的重组腺病毒本身即可引起内皮细胞带状闭合蛋白1形态的变化。结论晚期糖基化终产物刺激可以引起内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1分布和形态的变化,这一作用可能是由细胞外信号调节激酶及p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路介导的。

缺氧诱导因子1α对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及相关机制

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及相关机制。方法取12只雄性SD大鼠,35~38d龄,分离主动脉培养血管内皮细胞,4d后观察细胞形态,并取第2或3代细胞进行以下实验。(1)取大鼠血管内皮细胞,采用随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组,每组3孔。阴性对照组和HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组细胞经脂质体2000分别转染GV248空质粒和含HIF-1α干扰序列1、干扰序列2、干扰序列3的GV248重组质粒,空白对照组细胞仅加入脂质体2000。转染24h后,采用实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法(检测方法下同)分别检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白的表达,选取干扰效率最高的序列。(2)另取大鼠血管内皮细胞,分为空白对照组、阴性对照组和HIF-1α低表达组,每组3孔。空白对照组细胞仅加入脂质体2000,阴性对照组和HIF-1α低表达组细胞经脂质体2000分别转染GV248空质粒及实验(1)中筛选的低表达HIF-1α重组质粒。培养14d,检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平。(3)另取大鼠血管内皮细胞,分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α高表达组,每组3孔。空白对照组细胞仅加入脂质体2000,阴性对照组、HIF-1α高表达组细胞经脂质体2000分别转染GV230空质粒和HIF-1α高表达重组质粒。培养14d,检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平。(4)取实验(1)中3组、实验(2)中3组细胞,检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)和带状闭合蛋白1(ZO-1)的mRNA和蛋白表达水平。对数据行单因素方差分析、t检验。结果培养4d,细胞呈梭形,成功培养出大鼠血管内皮细胞。(1)HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组细胞HIF-1α的干扰效率分别为47.66%、45.79%、62.62%,干扰序列3组细胞干扰效率最高。转染24h后,HIF-1α干扰序列3组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组(t=18.404、9.140,P<0.01)及阴性对照组(t=15.099、7.096,P<0.01)。(2)培养14d后,HIF-1α低表达组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组(t=21.140、5.440,P<0.01)和阴性对照组(t=14.310、5.210,P<0.01)。(3)培养14d后,HIF-1α高表达组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组(t=19.160,7.710,P<0.01)及阴性对照组(t=19.890、7.500,P<0.01)。(4)转染24h后,HIF-1α低表达组细胞MLCK、p-MLC的mRNA表达水平显著低于空白对照组(t=2.709、4.011,P<0.05或P<0.01)和阴性对照组(t=2.373、3.744,P<0.05或P<0.01),HIF-1α低表达组细胞ZO-1的mRNA表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(t=4.285、5.050,P<0.01)。HIF-1α高表达组细胞MLCK、p-MLC的mRNA表达水平显著高于空白对照组(t=9.118、11.313,P<0.01)和阴性对照组(t=9.073、11.280,P<0.01),HIF-1α高表达组细胞ZO-1的mRNA表达水平显著低于空白对照组和阴性对照组(t=2.889、2.640,P<0.05)。(5)转染24h后,HIF-1α低表达组细胞MLCK、p-MLC的蛋白表达水平显著低于空白对照组(t=2.652、3.983,P<0.05或P<0.01)和阴性对照组(t=2.792、4.065,P<0.05或P<0.01),HIF-1α低表达组细胞ZO-1的蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组(t=3.881、3.570,P<0.01)。HIF-1α高表达组细胞MLCK、p-MLC的蛋白表达水平为1.18±0.24、0.68±0.22,显著高于空白对照组的0.41±0.21、0.35±0.14(t=5.011、3.982,P<0.05或P<0.01)和阴性对照组的0.43±0.20、0.36±0.12(t=4.880、3.862,P<0.05或P<0.01)。HIF-1α高表达组细胞ZO-1的蛋白表达水平为0.08±0.06,显著低于空白对照组的0.20±0.09和阴性对照组的0.19±0.09(t=4.178、3.830,P<0.05或P<0.01)。结论HIF-1α通过上调MLCK、p-MLC,下调ZO-1的表达,从而增加大鼠血管内皮细胞通透性。

缺氧人肠上皮细胞Slingshot蛋白表达变化及其与屏障功能的关系

目的研究缺氧对人肠上皮细胞Slingshot蛋白表达的影响及其与屏障功能变化的关系。方法建立人肠上皮细胞株Caco-2单层细胞培养模型。取细胞按照随机数字表法分为6部分，分别行缺氧处理0h（即刻）及1、2、6、12、24h，采用生物电阻测定仪测定细胞的跨上皮电阻（TER）。另取细胞同前行缺氧处理，采用蛋白质印迹法检测带状闭合蛋白1（ZO-1）、咬合蛋白、闭合蛋白1及Slingshot-1、Slingshot-2、Slingshot-3的蛋白表达。另取细胞同前行缺氧处理，采用荧光法检测纤维状肌动蛋白及球状肌动蛋白含量。3项检测中，各时相点样本数分别为10、10、18。对数据行单因素方差分析、Dunnett检验。结果（1）与缺氧0h比较，缺氧1—24h细胞的TER值均明显降低（P值均小于0．01）。（2）与缺氧0h（均为1．00）比较，缺氧1～24h细胞的ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1表达量普遍降低，于缺氧12h或24h达到最低值（分别为0．69±0．20、0．47±0．15、0．474-0．22，P〈0．05或P〈0．01）。与缺氧0h比较，缺氧1～24h细胞的Slingshot-1、Slingshot-3蛋白表达量无明显变化（P值均大于0．05）；缺氧1～24h，细胞的Slingshot-2蛋白表达量呈先降低后上升的趋势，其中缺氧24h（1．544-0．57）明显高于缺氧0h（1．00，P〈0．05）。（3）与缺氧0h比较，缺氧1、6、12、24h细胞的纤维状肌动蛋白含量明显减少，缺氧6～24h细胞的球状肌动蛋白含量明显增加，P〈0．05或P〈0．01；其余时相点2项指标无明显变化（P值均大于0．05）。结论缺氧通过诱导人肠上皮细胞Slingshot-2表达，引起丝切蛋白去磷酸化而活化以及纤维状肌动蛋白解聚，从而影响细胞间紧密连接，导致细胞屏障功能受损。