实时荧光重组酶聚合酶扩增检测大肠埃希氏菌O157

目的建立实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测大肠埃希氏菌O157的分析方法。方法根据大肠埃希氏菌O157的rfbE基因(S83460.1),设计特异性引物和exo探针,分别进行引物探针筛选和特异性、灵敏度以及稳定性探究,并对人工污染样品和实际样品进行检测,验证本研究方法的实用性。结果本方法在37℃恒温20 min内可完成对大肠埃希氏菌O157的定性检测,目的DNA的检测限为0.01ng/μL,目的菌的检测限为10~3CFU/mL。在稳定性实验中,选择从100~0.001 ng/μL的10倍梯度稀释的目的DNA进行每个浓度8个平行的测试,0.01 ng/μL及以上浓度的DNA的8个平行均可稳定检出。对于大肠埃希氏菌O157的初始污染量为4 CFU/25 g的牛奶和鸡肉人工污染样品,增菌9 h后,可检出其中的目的菌。用本方法和国标方法GB 4789.36-2016同时检测20份实际样品,结果一致。结论该方法快速、简便,可作为一种常温下大肠埃希氏菌O157的快速检测手段,应用于基层实验室或现场检测。

用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸

体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术,自问世以来,被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域,并被不断改进,以使其功能和适应性更为广泛.重组酶介导扩增法是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术.RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程,实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增,无需特殊的辅助仪器,对操作人员的要求也不高,具备简单、节能、便携、快速等特点,有望在不远的将来取代传统的热循环PCR反应.