基于ERIC-PCR指纹图谱技术的小鼠肠道菌群失调分析方法的建立

目的采用常规菌群分析方法和ERIC-PCR技术对正常小鼠和抗生素相关性腹泻小鼠模型分别进行肠道菌群检测,结合细菌培养和DNA指纹图谱检测结果分析小鼠肠道内主导菌群数量和种类的改变情况,建立利用ERIC-PCR技术分析小鼠肠道菌群失调的检测方法。方法先利用常规菌群分析方法鉴定正常小鼠和抗生素相关性腹泻小鼠的菌群状况,再提取其基因组DNA,最后以肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)为模板,利用ERIC-PCR方法获得正常小鼠和模型小鼠的肠道菌群指纹图谱,与常规菌群分析结果作比较,验证ERIC-PCR技术的准确性。结果常规菌群分析结果表明四种优势菌群在数量上出现明显的变化,证实造模成功。经ERIC-PCR技术成功获得两组小鼠粪便基因组DNA图谱,两组间呈现具有一定对比性的特异性指纹图谱。结论从小鼠粪便基因组经ERIC-PCR后的图谱中特异性条带的分布、数目和亮度来看,能说明肠道菌群的分布状况存在明显差异,结合常规菌群分析方法作对比,说明ERIC-PCR技术是一种分析小鼠肠道菌群失调高效快捷的检测方法。

2型糖尿病合并急性胰腺炎大鼠肠道微生物ERIC-PCR指纹图谱的分析

目的应用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacteria repetitive intergenic consen sussequencespolymerase chain reaction,ERIC-PCR)技术检测2型糖尿病合并急性胰腺炎后大鼠肠道内菌群的数量及多样性的改变情况。方法40只10周龄雄性大鼠,其中20只Wistar大鼠,随机分为空白对照组(QB组)、单纯急性胰腺炎大鼠模型(AP组);20只Goto-kakisaki自发性2型糖尿病大鼠(GK大鼠)随机分为2型糖尿病组(DM组)、2型糖尿病合并急性胰腺炎组(DAP组);每组10只,分别标号。其中AP组、DAP组作为造模组。检测DAP组和AP组24 h血清胰淀粉酶活性水平和随机血糖。48 h后:(1)处死各组大鼠,取胰腺观察病理损伤程度并以改良Schmidt法为标准进行胰腺组织病理评分。(2)采集各组大鼠新鲜粪便,并提取新鲜大鼠粪便基因组,进行基因组扩增,将PCR产物点样于琼脂糖凝胶,制作目的 ERIC-PCR指纹图谱;(3)同时将采集的新鲜粪便处理后制成不同浓度梯度细菌悬浊液,接种于BBL琼脂培养基、MRS肉汤培养基、SS琼脂培养基、MAC琼脂培养基上培养并计数。结果 (1)AP组、DAP组病死率分别是20%(2/10)和40%(4/10),QB组、DM组无死亡,DAP组病理评分最高;(2)DAP组术后24 h血糖水平较AP组升高,差异具有统计学意义(t=2.24,P<0.05);DAP组术后24 h血淀粉酶较AP组无明显变化,两组比较差异无统计学意义(t=6.40,P=0.53);(3)肠道菌群多样性指数、ERIC-PCR指纹图谱及相似性聚类分析显示,DAP组特征性条带数量减少且肠道菌群多样性改变;(4)4组间肠道微生物菌群比较,差异具有统计学意义。进一步两两比较,DAP组的双歧杆菌和乳酸杆菌低于QB组和AP组,差异具有统计学意义(P<0.05);DAP组的大肠杆菌和变形杆菌高于QB组和AP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 (1)2型糖尿病大鼠并发急性胰腺炎后肠道菌群的结构均发生改变,菌群多样性减少;益生菌减少及条件致病菌增多;(2)肠道菌群的变化参与2型糖尿病合并急性胰腺炎的病程进展。