Smad9基因干扰表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及内分泌的影响

为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子Smad9对鹅卵泡发育的调控作用,研究采用RNAi技术干扰Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位,Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析,探讨Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示,SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞,Smad9-siRNA显著抑制Smad9的表达。Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低,细胞上清中雌二醇(E 2)的水平显著下降,孕酮(P 4)水平未见明显变化,细胞色素P450芳香化酶基因(CYP19A1)和促黄体素受体(LHR)基因的表达显著下降,促卵泡素受体(FSHR)基因的表达无显著变化。这些结果表明,干扰Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响,其机制可能是Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E 2合成减少和LHR的表达下降有关。

RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象,它作为一种有效的工具用来产生转录后沉默,从而抑制特定基因的表达,成为基因功能研究的一种新方法,除了在模式昆虫如果蝇Drosophila中广泛应用之外,也在非模式昆虫中得到成功应用。近年来,RNAi技术在导入方法和基因功能分析方面都取得了飞速发展,且与转基因技术相结合成功应用于害虫防治领域。本文综述了RNAi技术在导入方法、昆虫功能基因组功能分析及害虫防治等领域新近的研究成果,并展望了该技术的应用前景。

昆虫的RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种强有力的分子生物学技术,在昆虫研究中得到了较多的应用。目前,RNAi技术主要应用于昆虫功能基因和功能基因组研究,已在多个目的19种昆虫上实现了RNAi。在昆虫上实现RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、转基因和病毒介导等方法,这些方法各有特点,其中喂食法因其简单而最有应用前景。昆虫RNAi的系统性较为复杂,只有部分昆虫具有RNAi的系统性。昆虫中RNAi信号传导的基因可能是sid-1,但昆虫RNAi的系统性机理还不是很清楚。转基因植物产生的dsRNA实现了对作物的保护,证实了RNAi技术可用于害虫控制,为害虫控制开辟了新领域。昆虫的RNAi研究处在起步阶段,研究昆虫RNAi的机理,特别是RNAi在昆虫体内的系统性扩散机理,改进实现RNAi的方法,提高RNAi技术在昆虫研究中的应用,有利于昆虫基因功能鉴定和害虫控制,促进昆虫学科的发展。

基于RNAi技术转移脂肪酸延长酶基因fae1及转基因油菜的获得

通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因(fae1)表达,获得了油菜脂肪酸延长酶基因(fae1)功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实,成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因(fae1)反向重复结构RNAi载体;通过农杆菌介导的油菜转化,经RCR及印染检测,获29个油菜转基因再生株系。

甘蓝型油菜脂肪酸延长酶FAE1 RNA干扰体的构建

利用来源于油菜fae1基因编码区的长498bp的2个片段,反向连接于1个83bp的内含子两端,构建成RNAi载体,以期在油菜中转录后能有效抑制fae1基因的表达。所构建的RNAi载体最终序列全长2 066bp,经限制性内切酶消化及序列测定验证,其序列结构与设计一致。通过农杆菌介导的油菜转化,获得油菜再生株系29个。

干扰ClC-2基因表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响

目的观察抑制容积调控氯通道ClC-2基因的表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响。方法设计和构建两个针对ClC2基因的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒和两个重组质粒分别转染入BT-325细胞(依次为对照组、PP1组和PP2组);通过RTPCR检测ClC2基因mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期。结果与对照组相比较,干扰组ClC2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期。结论干扰胶质瘤细胞系BT-325细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的生长,提示ClC2基因可能成为控制胶质瘤恶性生长的新靶点。

罗氏沼虾RXR基因克隆及其对蜕皮相关基因的调控

为研究维甲酸类X受体(RXR)在甲壳动物蜕皮过程中的调控作用,实验采用RACE技术克隆获得罗氏沼虾Mr-RXR基因,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了Mr-RXR及其他蜕皮相关基因(MIH、EcR、E75和CHIT)在罗氏沼虾不同组织、不同蜕皮阶段的表达情况,并采用RNA干扰(RNAi)探究Mr-RXR对罗氏沼虾蜕皮相关基因表达的调控作用。结果显示,Mr-RXR基因cDNA全长2241 bp(GenBank登录号MZ501612),包括36 bp的5'末端非翻译区(UTR)和719 bp的3'UTR,开放阅读框(ORF)为1386 bp,共编码461个氨基酸。罗氏沼虾RXR氨基酸序列与甲壳动物同源性较高,存在保守的DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)。Mr-RXR在罗氏沼虾所有组织中均表达,精巢、眼柄、心脏等组织中表达量较高,其表达水平随蜕皮周期改变,眼柄和肌肉组织中均在蜕皮前期表达量最高,与EcR基因表达模式基本同步;E75和CHIT基因表达模式较为相似,眼柄和肌肉组织分别在蜕皮前期和蜕皮后期高表达;MIH基因仅在眼柄组织表达,且蜕皮间期表达量最高。采用3μg dsRNA/g虾的剂量进行为期12 d的RNAi实验诱导Mr-RXR沉默,罗氏沼虾出现大量死亡,qRT-PCR显示,眼柄和肌肉中Mr-RXR干扰效率分别为79%和55%。眼柄组织中Mr-RXR基因沉默后,MIH基因表达未受影响,EcR、E75和CHIT基因表达水平显著降低,肌肉组织中,Mr-RXR沉默仅造成CHIT基因表达水平的显著下降,推测Mr-RXR可能通过影响EcR、E75和CHIT基因表达调控罗氏沼虾蜕皮过程。本研究结果将为甲壳动物蜕皮调控机制研究提供基础资料。

RNAi对绵羊颗粒细胞体外培养过程VEGF及其受体mRNA表达的影响

【目的】明确RNA干扰(RNAi)对绵羊颗粒细胞体外培养过程中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体mRNA表达的影响,为开展VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础。【方法】采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内,利用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化。设定筛选出的Flt-1和KDR/Flk-1有效干扰片段分别为试验组Ⅰ和试验组Ⅱ,两个干扰片段共同作用为试验组Ⅲ,无效的干扰片段为对照组。【结果】绵羊颗粒细胞体外培养过程中,VEGF mRNA在各时间段的相对表达量是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍;培养第1 d时,试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组ⅢVEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2,均极显著高于对照组(P<0.01,下同),3个试验组的VEGF mRNA表达量从第2 d开始降低,直到第6 d与对照组趋于一致。试验组ⅡFlt-1 mRNA相对表达量从培养第1 d的1.02×10-1逐渐降至第7 d的8.99×10-4,且一直极显著高于其他组;试验组Ⅰ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无Flt-1 mRNA表达,随着培养时间的延长逐渐呈上升趋势,第8 d时各组趋于一致。试验组Ⅰ的KDR/Flk-1 mRNA相对表达量从第1 d开始极显著低于对照组;试验组Ⅱ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无KDR/Flk-1 mRNA相对表达,随着培养时间的延长呈上升趋势,第9 d时各组趋于一致。【结论】两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用,可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量,进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输。

RNAi技术及其在基因组学研究中的应用

RNA干扰(RNA in terference,RNA i)是一种真核生物体内的基因调控机制.在介绍RNA i的作用机制及作用特点的基础上,综述了其在基因功能研究、基因组免疫系统、人类疾病的基因治疗及水产养殖病害的防治等基因组学研究领域的最新进展与应用.

靶向RNAi抑制survivin基因增强胰腺癌对厄洛替尼化疗敏感性的实验研究

目的:胰腺癌的化疗药物耐药是一个亟待解决的问题。存活素(survivin)基因是肿瘤化疗耐药的重要原因。运用RNAi载体抑制survivin的表达对增强胰腺癌对厄洛替尼敏感性的影响。为增强胰腺癌化疗敏感性奠定一定的实验基础。方法:培养胰腺癌细胞PANC-1,构建以U6为启动子的RNAi载体并转染PANC-1,运用FCM检测加入厄洛替尼前后胰腺癌细胞凋亡指数和Hoechest 33258检测凋亡形态,MTT检测转染前后IC50。结果:转染survivin的RNAi载体后48h,流式细胞仪检测的凋亡指数为15.24%±1.35%,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);Hoechst33258染色显示,PANC-1细胞出现核皱缩、浓染和碎裂等典型的凋亡形态,MTT检测转染前及转染后48h厄洛替尼的IC50分别为(1.35±0.05)μg/mL,(0.46±0.08)μg/mL,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:Sur-vivin的RNAi载体,能有效地增强胰腺癌对厄洛替尼的化疗敏感性。

特异性干扰ICP27基因的siRNA对HSV-1病毒复制的影响

针对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)的ICP27基因和其他疱疹病毒相关基因的高度保守区设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),研究其抑制病毒复制的效果。首先构建相应的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),然后通过病毒滴度测定、real-time PCR和细胞致病变效应(cytopathic effect,CPE)检测所设计的siRNA抑制病毒复制的能力。结果显示,所设计的shRNA-2(靶序列起始位置815)和shRNA-3(靶序列起始位置1 367)具有明显地抑制病毒复制的效果。尤其是shRNA-3,抑制病毒复制的效果更明显,在病毒滴度实验中,与阴性对照相比,其抑制倍数为81,同时可以下调ICP27基因的mR NA表达水平。实验结果表明shRNA-3能够显著抑制HSV-1病毒复制的能力,可以作为HSV-1感染性疾病的补充治疗手段,其对应的靶序列可以作为抗HSV-1新的靶标。

RNA干扰在治疗脑胶质瘤中的研究

脑胶质瘤是颅内肿瘤中一类高发病率、高致残率、高死亡率的肿瘤,但目前,其临床治疗效果难以令人满意。如何提高疗效、改善预后是神经外科工作者研究的重点。RNA干扰(RNAi)技术作为一项新的基因治疗技术,因其独特的作用机制和优越性,正越来越受到研究者的重视。近几年,RNAi在治疗脑胶质瘤研究方面不断深入,对多种干扰策略中多个基因靶点的研究都取得了进展,并朝着联合干扰的方向发展,同时在载体和给药途径等技术环节上也有了很大改进。RNAi技术的发展将为脑胶质瘤的治疗带来新的希望。

RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰(RNAi)指由ds RNA或si RNA诱发的转录后基因沉默现象,其机制是通过与靶序列特定位点互补配对,通过阻碍靶基因的翻译或者诱导m RNA降解来抑制基因表达,是一项高效率、强特异性的基因沉默技术。RNAi技术不仅在基础研究方面成为基因功能和蛋白功能研究的工具,也广泛的应用于临床研究,在肿瘤、病毒性疾病以及其他疾病的治疗方面显示了广阔的前景。

RNA干扰降低膀胱TGF-β1表达能够改善脊髓损伤大鼠的膀胱功能和纤维化

目的探索通过RNA干扰(RNAi)降低膀胱TGF-β1表达治疗神经源性膀胱(NB)的效果。方法将48只雌性大鼠均分为假手术组、T10脊髓横断组、LV-vector组和LV-shTGF-β1组。假手术组行T10脊髓横断假手术,其余3组行脊髓横断。术后即行膀胱壁注射,前两组为0.9%氯化钠溶液,LV-vector组为对照病毒,LV-shTGF-β1组为TGF-β1 RNAi慢病毒。术后第28天测压和称重膀胱,并将膀胱组织用HE和Masson染色,用免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测逼尿肌TGF-β1的表达。结果与假手术组相比,其余3组逼尿肌过度活动的次数和幅度显著增加(P<0.01),膀胱容量显著减小(P<0.05),膀胱质量和逼尿肌间质含量以及TGF-β1表达显著增加(P<0.05);T10脊髓横断组与LV-vector组相比,两者各项指标差异无统计学意义;LV-shTGF-β1组与T10脊髓横断组或LV-vector组相比,其逼尿肌过度活动的次数和幅度显著减少(P<0.01),膀胱容量显著增加(P<0.01),膀胱质量和逼尿肌间质含量以及TGF-β1表达显著减少(P<0.05)。结论RNAi降低膀胱TGF-β1表达能够改善脊髓损伤大鼠的逼尿肌过度活动和膀胱纤维化。

HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人HIF-1α的mi R RNAi慢病毒载体。方法利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的mi RNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1αmi R,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-mi R表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定。结果经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的mi RNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1αmi R。结论成功构建针对人HIF-1α基因的mi RNA慢病毒RNA干扰载体。

RNAi在胃癌研究中应用的进展

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,其发病率在恶性肿瘤中占第四位,死亡率居第二位,且胃癌发病率在世界不同国家和地区有较大的差异,表现出明显的地域性。RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)在哺乳动物细胞中是利用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)诱导特异性基因表达抑制,具有基因抑制效果确切、抑制具有严格的序列特异性、作用迅速等特点,已被广泛用于胃癌相关基因功能、胃癌化疗的多药耐药、胃癌的治疗方面的研究和探索。随着对RNAi机制的深入研究,相信不久的将来RNAi技术能在肿瘤的基因治疗方面发挥越来越重要的作用。

组蛋白乙酰化酶RNAi慢病毒文库构建及其对胆囊癌细胞的感染

目的构建人基因组中16个组蛋白乙酰化酶的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体文库,为进一步研究表观遗传因子对胆囊癌的调控机制提供有利的工具。方法依据shRNA引物设计原则,分别针对每个基因设计4对shRNA引物,将引物退火形成粘性末端后连接至慢病毒载体;经菌落PCR、酶切验证正确后,进行转化及质粒抽提。结果构建了16个组蛋白乙酰化酶基因的shRNA慢病毒载体,共64个shRNA慢病毒载体克隆;并对胆囊癌细胞SGC996和GBC-SD进行了病毒感染的MOI值(multiplicity of infection)摸索,以确保可通过RNAinterference(RNAi)慢病毒干扰的方式对这两株细胞进行研究。结论成功构建了16个组蛋白乙酰化酶的shRNA慢病毒载体,从而为在SGC996和GBC-SD胆囊癌细胞中研究人组蛋白乙酰化酶奠定坚实的基础。

针对PAI基因的小干扰RNA特异性调节PAI及tPA表达的实验研究

目的设计针对纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI)基因的小干扰RNA(PAI siRNA),研究其对PAI和组织型纤溶酶原激活物(tPA)表达的影响。方法体外化学合成PAI siRNA,电转染法转染人主动脉平滑肌细胞(HASMC),采用RT-PCR及Western印迹法分别从mRNA和蛋白水平上检测转染细胞PAI及tPA蛋白的表达情况。结果转染细胞PAI mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显下降(P<0.01),tPA蛋白表达较对照组明显升高(P<0.01)。结论PAI siRNA可快速特异性封闭PAI基因表达,并调节tPA蛋白表达,使其升高,为进一步研究PAI在血栓性疾病中作用机制以及探讨PAI与tPA之间关系提供了实验基础。

遗传学研究的新工具:RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是近年来发现的一个新的遗传学现象,近年来在遗传学的研究中已用于基因功能的研究,遗传病的基因治疗等领域,成为遗传学研究的新工具。本文就其在遗传学方面的应用作一综述。