炎性因子干扰素γ以焦亡途径影响人血管平滑肌细胞的迁移和凋亡

背景:子宫螺旋动脉重铸的顺利进行是正常妊娠的必要条件之一,血管平滑肌细胞是此过程的重要细胞。干扰素γ与妊娠早期螺旋动脉血管平滑肌细胞丢失相关,但具体机制尚未明确。目的:探讨干扰素γ通过NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径对血管平滑肌细胞迁移、凋亡生物学功能的影响。方法:人血管平滑肌细胞分为对照组和干扰素γ组,对照组正常培养,干扰素γ组采用10 ng/mL干扰素γ处理24 h。Transwell实验检测血管平滑肌细胞的迁移能力;荧光TUNEL实验及流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡情况;qPCR检测NLRP3和caspase-1 mRNA表达水平;Western blot检测NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD蛋白表达水平。结果与结论:与对照组相比,干扰素γ组血管平滑肌细胞的迁移能力及凋亡率显著升高(P<0.05);与对照组相比,干扰素γ组血管平滑肌细胞中NLRP3和caspase-1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与对照组相比,干扰素γ组血管平滑肌细胞中NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结果表明,干扰素γ可能通过NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径调控血管平滑肌细胞的迁移和凋亡。

重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。

干扰素α(IFN-α)和白细胞介素2(IL-2)联合应用预防肾癌根治术后复发和转移的远期效果评价

目的研究干扰素α和白细胞介素2联合应用对预防肾癌根治术后复发和转移的远期效果评价。方法针对在我院2006年3月份到2012年2月份接受治疗的200例肾癌根治术患者,根据术后具体治疗方法的不同进行分组,分别分为Ⅰ组(123例)和Ⅱ组(77例)。然后对两组采用不同的方法进行治疗,Ⅰ组采用干扰素α和白细胞素2联合的方法,Ⅱ组则只实行根治术。结果Ⅰ组患者CD4+高于Ⅱ组患者,CD4+/CD8+高于Ⅱ组,CD8+低于Ⅱ组。Ⅰ组患者三期2年生存率与二、三期4年生存率均高于Ⅱ组。结论干扰素α和白细胞2联合应用能恢复肾癌根治术后患者的免疫功能,增强机体抵抗肿瘤的免疫功能,有效减少复发率,提高了患者的生存率。

新型猫源干扰素FeIFN-ω与干扰素FeIFN-α的表达及抗病毒活性比较

ω型干扰素(IFN-ω)与α型干扰素(IFN-α)同属于Ⅰ型干扰素,都具有抗病毒,抗增殖和免疫调节的功能,但它们之间的活性却存在较大差异。通过PCR扩增猫ω型干扰素基因(FeIFN-ω),根据GenBank公布的猫α型干扰素基因序列,合成猫α型干扰素基因(FeIFN-α)。分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-α和pET-His/FeIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,复性后蛋白用细胞病变抑制法进行抗病毒活性测定。结果显示,重组猫ω型干扰素(FeIFN-ω)抗病毒活性明显高于重组猫α型干扰素(FeIFN-α),尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒(CDV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat对CDV和AIV均未表现活性。以上研究为以ω型干扰素为基础的抗病毒药物应用奠定了重要的理论基础。

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。

γ干扰素(IFN-γ)刺激小鼠肥大细胞释放组织蛋白酶S

目的探讨γ干扰素(IFN-γ)对P815小鼠肥大细胞以及小鼠髓源性肥大细胞(BMMC)表达组织蛋白酶S(CTSS)的影响。方法用(10、25、50)ng/m L IFN-γ分别刺激P815细胞及原代培养的小鼠BMMC,利用实时定量PCR、ELISA分别检测P815细胞及BMMC CTSS的mRNA和蛋白水平。用25 ng/m L IFN-γ处理P815细胞及小鼠BMMC,P815细胞分别处理6、12、18、24、48、72 h,BMMC分别处理12、24、48 h,重复上述检测步骤。结果 IFN-γ可增加P815细胞及BMMC CTSS的mRNA和蛋白水平,并具有一定的时间、剂量依赖关系。结论 IFN-γ可促进小鼠肥大细胞表达CTSS。

肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合应用对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组蛋白肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与化疗药物5-氟尿嘧啶联合使用在体外对人非小细胞肺癌细胞株A549的作用,为IFN-α2a-NGR的临床实验设计提供实验依据。方法:不同浓度的肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR、5-氟尿嘧啶单独及联合作用于细胞株A549,通过MTT法检测单药及联合用药对细胞增殖的影响,经AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察药物作用的细胞形态。结果:IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合作用于A549细胞株时,其细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均较单独作用时高,具有统计学显著性差异(P<0.05);荧光显微镜观察可见药物作用后细胞形态改变。结论:肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。

人γ干扰素突变体(rIFN-γ132-PGIL)的构建及其生物学活性的测定

利用DNA重组技术,去掉人γ干扰素(IFNγ)基因3′端含编码多肽羧基(C)端11个氨基酸的核苷酸序列,与编码P,G,I,L的DNA序列相连接,构成IFNγ突变体(rIFN-γ132-PGIL)基因,将后者插入pBV220P_RP_L串连启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,在CIts857基因的调节下,通过升温诱导,获得了高效表达,表达量约占菌体可溶性蛋白的30％以上,抗病毒活性平均可达4.9×10^-8U/L,比母体菌株高10倍。SDS—PAGE结果表明,rIFN-γ132—PGIL分子量为17kd。

慢性乙型肝炎患者IFN-α/β受体和细胞因子表达与干扰素疗效间的关系

目的:检测慢性乙型肝炎(CHB)患者α干扰素治疗前后血清中细胞因子及受体水平及治疗前外周血单个核细胞(PBMCs)中Ⅰ型干扰素受体,并观察α干扰素疗效,以探讨α干扰素与病毒复制消长的关系。方法:采用酶标(ELISA)法检测22例CHB患者治疗前后血清中细胞因子及受体(IL6,IL2,TNFα,IL8,sIL2R)水平,并用链霉亲和素生物素酶复合物法(SABC)检测α干扰素治疗前患者PBMCs中IFNα/β受体表达。结果:治疗应答者血清IL6,sIL2R水平下降明显,而IL2水平则明显上升。22例CHB患者中,干扰素治疗完全应答者7例,其中IFNα/β受体高表达者6例,占85.71%;干扰素治疗无应答者11者,其中IFNα/β受体高表达者3例,占27.27%。两者间比较差异有显著性意义(P<0.05)。部分应答者4例,IFNα/β受体高表达者2例。结论:干扰素治疗CHB患者其疗效与细胞膜上IFNα/β受体表达水平和血清细胞因子的调节密切相关。应重视对IFNα/β受体及血清中细胞因子及受体水平的监测,以提高α干扰素抗乙肝病毒的疗效。

聚乙二醇a干扰素对慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、IL-17、IL-10的影响作用及机制

目的:研究干扰素-g(interferon-g,IFN-γ)、白介素(interleukin,IL)-17与IL-10在慢性乙型肝炎发病中的作用机制,观察聚乙二醇a干扰素(polyethylene glycol interferona,PEG-IFNa)抗病毒治疗对上述细胞因子水平的影响.方法:应用PEG-IFNa治疗的不同时间点抽取慢性乙型肝炎患者及健康对照组静脉血,分离血清,检测血清中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsA g)、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量(HBV DNA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)以及血清中的IFN-γ、IL-17、IL-10.结果:慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-17、IL-10的水平均显著高于健康对照组(P<0.01).抗病毒治疗后,慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、IL-17和IL-10的水平均较治疗前显著性下降(P<0.05).结论:IFN-γ、IL-17、IL-10共同参与了慢性乙型肝炎的发病,此结论对预测抗病毒疗效有指导意义.

重组猪γ干扰素对仔猪外周血T淋巴细胞亚群及IL-2、IFN-γ水平影响的研究

选28日龄健康仔猪16头,随机分为4组。1组为对照组,肌肉注射生理盐水;2-4组为试验组,分别肌注重组猪IFN-γ注射液（rpoIFN-γ）4万、40万、400万单位/头,注射液体积均为4 ml,研究rpoIFN-γ对猪外周血T细胞亚群及血清IL-2、IFN-γ含量的影响。结果发现：2组在试验第7天CD3^＋亚群比例、第7天和第14天CD4^＋亚群比例及CD4^＋/CD8^＋比值、第1天和第3天血清IL-2水平显著高于对照组（P〈0.05）;3组在试验第14天CD3^＋和CD4^＋亚群比例、CD4^＋/CD8^＋比值、血清IFN-γ含量,第7天、28天CD8^＋亚群比例,第14天、21天、28天血清IL-2含量显著高于对照组（P〈0.05）;4组CD8^＋亚群比例在第28天显著高于对照组（P〈0.05）。表明注射rpoIFN-γ对仔猪的细胞免疫有促进作用,肌注的适宜剂量是40万单位/头。

人干扰素ω(huIFN-ω)的高效表达、纯化及生物学活性

为了获得人干扰素 ω(huIFN ω)在大肠杆菌中的高效表达,根据大肠杆菌的偏爱密码子,人工设计并合成了huIFN ω高表达基因,并克隆到原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的15%左右,以包涵体形式存在。表达产物经变性、复性及阳离子和分子筛层析纯化,纯度达90%以上,产物的抗病毒活性约为1.0×108IU/mg,并具有体外促NK杀伤活性。此结果为进一步研究和开发重组huIFN ω奠定了基础。

人α1型干扰素突变体(IFN-α1/86D)的组建及其生物学活性的研究

本文采用核苷酸指导下的定位突变方法,以Asp置换了人α型干扰素86位的Cys,构建成突变体IFN-αI(86D)。后者在大肠杆菌中的表达水平比其母株(IFN-αI/86C)提高了2.8倍,IFN-αI(86D)在4℃的稳定性也较母株为高。

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的 建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法 采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果 纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论 此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。

激光联合干扰素治疗对阴道上皮内瘤变患者阴道微生态、炎症因子及预后的影响

目的分析激光联合干扰素对阴道上皮内瘤变(VAIN)患者的阴道微生态、炎症因子以及预后的影响。方法60例VAIN患者,按随机数字表法分为对照组和研究组,每组30例。对照组患者通过二氧化碳(CO_(2))激光治疗,研究组患者通过CO_(2)激光联合干扰素治疗。比较两组患者临床治疗效果;并发症发生情况;治疗前后炎症因子指标[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)、Toll样受体2(TLR2)];生存素(Survivin)、增殖细胞核抗原(Ki-67)阳性表达情况。结果研究组患者的临床治疗总有效率96.67%高于对照组的73.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,研究组患者的TNF-α(9.66±0.43)ng/L、IL-10(8.83±0.54)ng/L、TLR2(6.31±0.29)ng/L均低于对照组的(12.09±0.78)、(10.79±1.36)、(7.95±0.46)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,研究组患者Survivin阳性表达率(24.45±2.97)%、Ki-67阳性表达率(20.71±2.49)%低于对照组的(36.21±3.96)、(40.58±3.83)%,差异有统计学意义(P<0.05)。研究组并发症发生率为6.67%(2/30),与对照组的10.00%(3/30)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论针对VAIN患者给予VAIN患者激光联合干扰素治疗的临床效果更佳,能够有效改善炎症因子指标及Survivin、Ki-67表达情况,减少患者并发症的发生,值得推广应用。

人干扰素α高效表达质粒pEE14.1-IFN-α的构建和表达

目的:构建人干扰素α的高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,并在真核细胞中验证其表达。方法:通过PCR获得人IFN-α基因,连入过渡载体pCI-GPI,然后克隆入高效表达载体pEE14.1中,构建重组表达质粒pEE14.1-IFN-α。瞬时转染293T细胞后48 h收获上清,采用ELISA,Western blot分别验证目的基因表达。结果:pEE14.1-IFN-α经酶切和测序分析,与预期设计完全一致,表明重组质粒构建成功。ELISA法检测瞬时转染细胞上清中α干扰素含量,浓度约为3.15 ng/mL,说明表达的蛋白有免疫活性,Western blot检测也显示该重组质粒在上清中分泌表达。结论:成功构建高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,为慢性乙肝免疫治疗提供新的备选方案。

鸡α干扰素基因真核表达载体pCAGGS-IFN-α的构建及其在293T细胞中的表达

为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。

新型干扰素—IFN-λ s的研究概况

Ⅲ型干扰素即IFN-λs是一种新型干扰素,家族包括IFN-λ1,IFN-λ2和IFN-λ3(也可分别称作IL-29,IL-28A和IL-28B);IFN-λs的功能性受体复合物是由CRF2-12(IFN-λ-R1/IL-28Rα)和CRF2-4(IL10-R-β)链组成的异二聚体,IFN-λs结合到受体上诱导受体异二聚体化,导致Jak-Stat信号转导途径的激活,从而发挥与Ⅰ型干扰素相似的生物学效应,IFN-λs的生物学效应包括抗病毒活性,抗肿瘤增殖,调节Th1、Th2及人类细胞因子反应,调节免疫活性,疾病治疗等方面。IFN-λs抗增殖功能不如Ⅰ型干扰素强烈,提示在骨髓抑制方面可能比Ⅰ型干扰素低,这为IFN-λs的临床应用研究提供新思路。

萧山鸡γ-干扰素(IFN-γ)成熟蛋白基因的克隆、原核表达及真核表达载体的构建

以有丝分裂原ConA诱导鸡脾脏淋巴细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术获得了萧山鸡γ-干扰素成熟蛋白基因495 bp的序列,GenBank登录号为DQ470471。序列分析表明,与已经发表的鸡γ-干扰素成熟蛋白基因序列的核苷酸同源性为95%-99.9%。将该cDNA序列构建得到鸡γ-干扰素的原核表达载体pET30a-ChIFN-γ,成功在大肠杆菌中表达了分子量20.88 kD的目的蛋白,与预期分子量一致;并构建得到了鸡γ-干扰素的pCI真核表达载体（pCI-ChIFN-γ）。

融合干扰素rPoIFN-α/β联合黄芪多糖抗病毒活性研究

以融合干扰素rPoIFN-α/β和黄芪多糖(APS)作为抗病毒药物,采用MTT法与细胞病变(CPE)抑制试验评价了二者联用抗PRRSV,CSFV和PRV 3种猪源性病毒的效果.结果显示,融合干扰素rPoIFN-α/β和黄芪多糖(APS)联合使用对PRRSV,CSFV和PRV 3种猪源性病毒抑制作用远远高于单独使用,体现出显著的协同抗病毒效应,为融合干扰素与黄芪多糖的联合用药防控病毒性疾病提供了理论基础.