STING启动子多态性与多发性骨髓瘤化疗后感染易感性的相关性分析

目的:探讨干扰素基因刺激因子(STING)启动子多态性与多发性骨髓瘤化疗后感染易感性的相关性。方法:选取2016年1月至2022年7月由本院收治的102例多发性骨髓瘤化疗患者,根据患者化疗后是否发生感染,分为感染组53例和非感染组49例。分析感染患者的感染部位、病原菌分布特征。比较两组患者STING基因启动子rs587777609位点的基因型分布。分析多发性骨髓瘤化疗后感染的危险因素。结果:感染部位中,消化系统占43.40%,呼吸系统占26.42%,泌尿系统占20.75%,皮肤黏膜占9.43%。感染病原菌中,革兰氏阴性菌占57.14%,革兰氏阳性菌占26.98%,真菌占15.87%。感染组STING基因rs587777609位点的CC基因型频率低于非感染组,TT基因型频率高于非感染组(P<0.05)。感染组合并糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、肾功能不全、血清白蛋白<35 g/L、ISS分期Ⅲ期、机械通气、留置导尿的比例均明显高于非感染组(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,合并糖尿病(OR=1.992)、血清白蛋白<35 g/L(OR=2.782)、ISS分期为Ⅲ期(OR=2.707)、机械通气(OR=3.031)、TT基因型(OR=2.401)均是多发性骨髓瘤化疗后感染的危险因素(P<0.05)。结论:STING启动子多态性与多发性骨髓瘤化疗后感染易感性有关,TT基因型患者的感染风险较高。

IPS-1 SNP在调控HBV感染后干扰素应答机制的研究

目的探讨干扰素β启动子刺激因子1(IPS-1)不同单核苷酸多态性(SNP)基因型对HBV感染后干扰素应答作用机制。方法利用IPS-1野生型和rs17857295、rs7262903、rs7269320三种SNP基因型慢病毒表达载体,转染目的细胞HepG2、HepG2.2.15细胞,qPCR检测HBV感染和IPS-1不同SNP基因型对目的基因表达情况的影响,检测细胞转染后IFN-βmRNA表达水平,探讨IPS-1不同SNP基因型对HBV感染后细胞干扰素应答的机制。结果 IPS-1rs17857295和rs7262903两种SNP基因型转染HepG2.2.15细胞后,IPS-1基因表达水平显著低于野生型转染组(451.77比712.53,498.71比712.53,P<0.01);但IFN-βmRNA表达水平显著高于野生型转染组(分别为5.33比0.98和3.59比0.98,P<0.01);rs7269320 SNP基因型过表达后,IPS-1基因表达水平显著低于野生型转染组(290.63比712.53,P<0.01),但IFN-βmRNA表达水平无明显变化(0.74比0.98)。另外,rs17859295基因型分别转染HepG2和HepG2.2.15细胞后,后者IFN-βmRNA表达水平显著高于前者(5.33比2.25,P<0.01)。结论 IPS-1 rs17857295和rs7262903两种SNP基因型HBV感染者,尤其rs17857295 SNP基因型,清除病毒的能力可能强于野生型的感染者;而IPS-1野生型和rs7269320 SNP基因型HBV感染者可能更易形成病毒感染的慢性化。

干扰素基因刺激因子启动子的克隆、鉴定及活性分析

目的克隆和鉴定干扰素基因刺激因子(STING)基因上游启动子序列,并评价其在人胚肾HEK-293T细胞中的启动活性。方法以人全血DNA为模板,PCR扩增STING启动子区2154bp序列。将此片段亚克隆至pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克隆位点,构建重组报告质粒pGL-3/STING。转染HEK-293T细胞,检测其荧光素酶活性,并利用生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果经酶切、测序鉴定,成功构建了含有STING启动子序列的表达质粒。与pGL-3基本质粒相比,pGL-3/STING启动子的相对荧光素酶活性增加(P<0.01)。STING启动子区域含SRY、HSF、AP1、Sp1/3、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白和GATA-1等多个转录因子结合序列。结论 STING转录起始位点上游2154bp区域在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性。

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的 :克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨。方法 :利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927^+77)的片段,亚克隆至p GL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点。结果:经酶切、测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒。与p GL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P<0.05)。通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177^-48)可能含有GATA、IK2、MZF1、SP1/SP3、STAT等转录因子结合位点。结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177^+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列。

银杏叶总黄酮对缺氧条件下大鼠星型胶质细胞活力、细胞凋亡率及IPS-1/TRAF6信号通路的影响

目的:探讨银杏叶总黄酮对缺氧条件下大鼠星型胶质细胞活力、细胞凋亡率及干扰素β启动子刺激因子1(IPS-1)/肿瘤坏死因子TNF受体相关因子6(TRAF6)信号通路的影响。方法:设立大鼠星型胶质细胞对照组(培养环境为20%O2、5%CO2、75%N2)、缺氧组(培养环境为1%O2、5%CO2、94%N2)、银杏叶总黄酮低、中、高剂量组(终浓度100,200,400μg·ml^-1)。培养结束后,测定各组细胞活力、凋亡水平、细胞周期、IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白水平。结果:与对照组比较,缺氧组光密度(OD)值、存活率水平显著降低(P<0.05),凋亡率、G1期水平、IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05);与缺氧组比较,银杏叶总黄酮各剂量组OD值、存活率水平显著升高(P<0.05),凋亡率、G1期水平、IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05);且各指标变化与银杏叶总黄酮浓度呈正相关(P<0.05)。结论:银杏叶总黄酮能提高缺氧条件下大鼠星型胶质细胞活力、抑制其凋亡;其机制与银杏叶总黄酮抑制星型胶质细胞IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白表达水平有关。

RLRs治疗多发性硬化症的研究进展

目前,多发性硬化症(MS)的病因及其发病机制尚未清楚。RIG-Ⅰ样受体(RLRs)是新发现的一类模式识别受体(PRRs),位于细胞质内,可识别病毒双链RNA的解旋酶,并通过自身的半胱天冬酶活化募集结构域(CARD)与干扰素β启动刺激因子(IPS)-1发生相互作用,形成IPS-1信号小体,诱导干扰素Ⅰ型(Ⅰ-IFN)的表达,从而启动免疫应答以及诱导抗病毒反应。研究发现,缺乏IPS-1的小鼠疾病将继续恶化,伴随高炎症反应,从而加重轴突损伤和脱髓鞘病变。此外,若启动免疫细胞上的RLRs,能缓解MS小鼠的炎症并预防髓鞘的断裂,从而降低麻痹的发生率。本文就RLRs治疗MS的研究进展进行综述。

一种改进型基于荧光蛋白重定位系统的丙型肝炎病毒滴度检测方法的建立

目的建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度。方法通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸(C462-540)的基因序列及含有SV40核定位信号的IPS-1(C462-540)基因序列,插入经同样酶切的慢病毒表达载体LV-CAG--EGFP-WPRE、LV-CAG—mCherry(RFP)-WPRE,构建表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-NLS-IPS-1(C462-540)的慢病毒重组表达质粒;在此基础上构建含有IPS-1(C462-540)-2A-EGFP-puro、IPS-1(C462-540)-IRES-EGFP-puro的慢病毒重组表达质粒;利用293T细胞包装含有IPS-1(C462-540)蛋白的重组慢病毒;感染Huh7.5细胞,流式细胞仪筛选稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的Huh7.5细胞,或用puromycin筛选稳定表达EGFP的Huh7.5细胞;利用10倍系列稀释的HCV感染上述细胞,检测HCV的滴度。结果测序表明4种慢病毒表达质粒构建正确;收获的慢病毒感染Huh7.5细胞48 h后,可见EGFP或RFP表达,经流式细胞仪分选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-IPS-1(C462-540)的细胞系,经puromycin筛选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)的细胞系;经10倍系列稀释的HCV感染后,弥散在细胞质中的点状EGFP、RFP会扩散到整个细胞或定位到细胞核中,在甲基纤维素的限制下形成明显的荧光噬斑点,通过计算荧光噬斑点数得到用Huh7.5-EGFP-IPS-1(462-540)-IRES-PURO、Huh7.5两种细胞检测的HCV滴度分别为(5.6±0.2)×10~5和(5.5±0.2)×10~5 PFU/mL,二者无显著差异。结论成功构建了含有绿色荧光或红色荧光报告系统的细胞系,建立了一种简单、快速检测HCV滴度的新方法。