干扰素β1a基因真核表达质粒的构建和表达

目的:构建干扰素β1a(IFN-β1a)的CHO表达体系,探讨人IFN-β1a在真核细胞中的表达效果。方法:采用全基因合成法获取重组人IFN-β1a基因,并通过点突变将IFN-β1a的17位半胱氨酸进行修饰,合成的基因经PCR扩增,连接入pSV2-dhfr质粒中,构建重组真核表达质粒pSV2-dhfr-IFN-β1a。将质粒转染至CHO-dhfr-细胞中,经MTX加压筛选,获得稳定生长的能够持续表达IFN-β1a的单克隆细胞株;提取细胞基因组DNA,进行PCR鉴定。收集细胞培养上清液,采用Wish细胞病变抑制法检测转染细胞中IFN-β1a的抗病毒活性。结果:重组真核表达质粒pSV2-dhfr-IFN-β1a经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;以转染细胞基因组DNA为模板,可扩增出IFN-β1a基因;转染后重组细胞表达的IFN-β1a具有抗病毒活性,达到3×105 IU.mL-1。结论:IFN-β1a基因真核表达质粒构建成功,并在CHO细胞中成功表达了具有较高生物学活性的IFN-β1a蛋白。

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。

重组人干扰素β1a对人骨髓间充质干细胞成软骨细胞定向分化的影响

重组人干扰素β(rhIFN-β)是通过基因表达的一种糖蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,虽有研究表明其他亚型干扰素如干扰素γ对细胞增殖和分化有一定的作用,但rh IFN-β对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)诱导分化的影响尤其是成软骨细胞定向分化的研究尚少。文中采用成球法研究在常规TGF-β3诱导分化培养基中添加重组IFN-β1a后对诱导hMSCs分化成软骨球的影响。hMSCs经诱导分化后,收集软骨球,通过定量检测糖胺多糖(GAG)含量、软骨球形态测定、Alcian Blue组织染色、Real-time PCR和Western blotting检测Sox9和CollangenⅡ的表达。结果显示,在常规TGF-β3诱导分化培养基中添加100 ng/mL IFN-β1a能显著提高GAG含量,增大软骨球尺寸,促进聚集蛋白聚糖形成,上调Sox9和CollangenⅡ的表达。研究结果表明,重组人IFN-β1a能够与TGF-β3联合作用促进h MSCs成软骨细胞定向分化。

重组人干扰素β1a的纯化及其理化性质

目的纯化重组人干扰素β1a(recombinant human interferonβ1a,rhIFNβ1a),并分析其理化性质。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体培养表达rhIFNβ1a的重组CHO细胞,细胞培养收获液经超滤浓缩、蓝胶亲和层析、脱盐和CM离子交换层析纯化后,采用水泡性口炎病毒抑制法测定rhIFNβ1a的效价;Lowry法测定蛋白含量;等电聚焦电泳法测定其等电点;SDS-PAGE和高效液相色谱法测定其纯度;Western blot法分析其免疫活性;SDS-PAGE和质谱仪测定其相对分子质量;圆二色谱法分析其二级结构。结果共纯化了3批样品,纯化的rhIFNβ1a平均蛋白浓度为0.284 0 mg/ml,平均比活可达1.06×108IU/mg,纯度达95%以上,蛋白质平均回收率为58.36%,蛋白质相对分子质量为20 445.0,等电点约为6.6,免疫活性良好,二级结构与国家标准品基本一致。结论成功纯化了rhIFNβ1a,并检测了其理化性质,为建立大规模制备rhIFNβ1a的生产工艺和制造检定规程,实现产业化奠定了基础。

干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究

IFN - β1b是大肠杆菌产生的 17位Cys被Ser替换的人IFN - β的类似物 ,为了获得高表达 ,使用了大肠杆菌的偏爱密码子 ,人工合成了IFN - β - 1b基因 ,插入质粒 pBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α。IFN - β1b的制备过程 ,包括发酵和一系列的纯化步骤。经修饰 ,IFN - β1b基因在启动子PRPL 控制下发酵表达 ,合成的蛋白质以包涵体的形式存在。培养的细菌经收集、裂解后 ,将包涵体释放出来 ,包涵体经含SDS的溶液溶解 ,DTT还原。纯化过程包括有机溶剂抽提、分子筛层析、脱盐、氧化复性和反相层析 ,并用旋转蒸发除去有机溶剂。IFN - β -

重组人干扰素-β1b对恒河猴免疫原性的影响

目的:研究重组人干扰素-β 1b(rhIFN-β1b)对恒河猴的免疫原性及其对疗效的潜在影响。方法:实验分溶剂对照组及rhIFN-β1b低、中、高剂量组,分别皮下注射1.25％人血清白蛋白0.36mL·kg-1及rbIFN-β1b 4.0×106,1.2×107及3.6×107IU·kg-1,连续90d。血清结合抗体测定采用ELISA法,中和抗体测定采用细胞病变抑制法。结果:给药3周后,3个给药组动物均出现rhIFN-β1b结合抗体,4周后抗体滴度达最大值,不同剂量组间在结合抗体滴度方面未见明显的剂量-反应关系。同时,给药3周后血清中出现中和抗体,以后抗体滴度逐步升高。停药30d后,中和抗体滴度逐渐降低。结论:恒河猴重复给予rhlFN-β1b后,体内产生结合抗体和中和抗体,但给药组动物未观察到明显的病理学和生化指标异常,提示该生物制品重复使用是安全的。

注射用重组人干扰素β1b的分离纯化及质量研究

目的:研制注射用重组人干扰素β1b(rhIFN-β1b)并对其质量进行鉴定。方法:采用高压匀浆破菌、离心分离包涵体、有机抽提、酸沉淀、SephacrylS-200、SephadexG-75等进行分离纯化,通过各种方法对终产品进行鉴定。结果:纯化的rhIFN-β1b比活性平均为2·59×107IU·mg-1,纯度超过99%,复性纯化后平均活性回收率为51·89%,其他各项技术指标均符合质量控制标准。结论:建立了大规模制备rhIFN-β1b的纯化工艺,研制出了符合规程要求的注射用rhIFN-β1b纯品,为临床研究奠定了基础。

地高辛标记探针检测重组人干扰素β_(1b)中DNA残留量

为检测注射用重组人干扰素β1b半成品中外源性DNA残留量,以重组人干扰素β1b工程菌基因组DNA为模板,用地高辛标记探针,并以此探针进行点杂交。结果证明,该方法检测灵敏度较好,特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素β1b制备过程中的质量监控及半成品的检定。

重组人干扰素β1a生物学活性MTS/PMS检测方法的建立

目的建立重组人干扰素β1a(Recombimant human interferon beta1a,rhIFNβ1a)生物学活性MTS/PMS检测方法。方法将MTS和PMS偶联作为染色液,建立IFNβ1a生物学活性检测方法,对细胞浓度、细胞病变时间、MTS工作浓度和染色时间进行优化,并绘制效应曲线。对建立的方法进行重复性、准确性验证,并与结晶紫染色法进行比较。结果优化后的MTS/PMS法的最佳反应条件为:细胞浓度1×105个/ml,细胞病变时间24～36 h,MTS工作浓度2 mg/ml,染色时间40 min;A570/630值与IFNβ1a保护Wish细胞S型效应曲线的相关系数(R2)均达0.99以上。不同检测板、相同加样位置的变异系数在6%～20%之间;相同检测板、不同加样位置的变异系数在13%～17%之间;检测IFNβ1a细胞收集液的回收率在86%～121%之间。该法检测rhIFNβ1a生物学活性效应曲线呈反"S"型,线型较好,R2值均在0.99以上,均比结晶紫染色法的R2值高,且比结晶紫染色法更稳定。结论已建立了rhIFNβ1a生物学活性MTS/PMS检测方法,适用于常规定量测定rhIFNβ1a的生物学活性。

干扰素-β1b治疗复发缓解型多发性硬化16例疗效及经验总结

目的评价东北地区复发缓解型多发性硬化(RRMS)患者应用IFN-β1b的疗效及安全性。方法统计16例RRMS患者用药前后的ARR、平均EDSS评分以评价IFN-β1b的疗效,总结IFN-β1b相关的药物不良反应及其严重程度,评价药物的耐受性及安全性,并进一步分析停药原因。结果 (1)16例RRMS患者平均应用IFN-β1b 11.7 m,治疗前后的ARR分别为(1.65±1.01)、(0.97±1.00),t=2.307,P<0.05,差异有统计学意义;治疗前后的平均DESS评分分别为(2.63±1.04)、(2.03±1.58),t=2.164,P<0.05,差异有统计学意义;(2)16例患者累计不良反应发生21例次,分别为流感样副作用9例,注射部位红肿或硬结7例,肝功能异常3例,轻度血白细胞降低1例,脱发1例,其中1例患者因持续肝功异常而停用IFN-β1b;(3)16例患者中2例患者停用IFN-β1b,1例患者因药物不良反应停用,1例患者认为IFN-β1b"无效"停用。结论 (1)IFN-β1b可降低RRMS患者的ARR,改善EDSS评分,延缓疾病的进展;(2)IFN-β1b相关的不良反应以流感样症状和注射部位反应最为常见,部分患者出现肝功异常,多数症状轻微可自行缓解,少数严重不良反应可于减量后继续使用或停用。

炎症相关因子IFN-α及TGF-β1在颅咽管瘤的表达及意义

目的探讨炎症相关因子IFN-α、TGF-β1与颅咽管瘤炎症反应的关系。方法采用免疫组化GTVisionTM法检测α-干扰素(interferon-α,IFN-α)、转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)在58例颅咽管瘤组织中的表达情况,比较不同病理类型颅咽管瘤、复发组及初发组颅咽管瘤组织中IFN-α、TGF-β1的表达水平。结果造釉细胞型及复发颅咽管瘤IFN-α表达广泛。44例造釉细胞型颅咽管瘤有40例IFN-α表达阳性(90.91%),鳞状乳头型14例中有12例表达阳性,造釉细胞型IFN-α阳性表达率明显高于鳞状乳头型(Z=-2.003,P<0.05)。16例复发颅咽管瘤均有IFN-α阳性表达,阳性表达率高于初发组(Z=-2.085,P<0.05)。TGF-β1在鳞状乳头型颅咽管瘤明显表达,14例中有10例阳性表达,而造釉细胞型44例仅有14例表达阳性(Z=-2.129,P<0.05)。经Spearman相关分析,在全部颅咽管瘤中,IFN-α与TGF-β1表达程度呈负相关(rs=-0.273,P<0.05)。结论颅咽管瘤存在复杂的炎症反应,炎症相关因子IFN-α、TGF-β1可能参与颅咽管瘤细胞的生长调控,两者之间可能存在拮抗作用。

葛根复方对重症肌无力大鼠IFN-γ和TGF-β1的影响

目的:研究葛根复方对重症肌无力大鼠干扰素γ(IFN-γ)和转化生长因子-β1(TGF-β1)影响,并探讨其作用机制。方法:将80只lewis大鼠随机分为4组,造模成功后分别给予阳性对照组(强的松),葛根复方组连续灌胃治疗4W给予药物治疗。结果:与空白组比较,造模组的IFN-γ表达水平显著升高,与模型组比较,强的松组和中药组大鼠的血清中IFN-γ含量明显降低;治疗后与强的松组比较,中药组IFN-γ含量要偏低与空白组比较,造模组的TGF-β1表达水平显著降低,与模型组比较,强的松组,中药组大鼠的TGF-β1含量明显升高;治疗后与强的松组比较,中药组TGF-β1含量要偏高。结论:葛根复方抑制了IFN-γ的含量,促进俄TGF-β1含量升高。

重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。

重组人干扰素β1b中ox-IFN β1b含量测定

目的:建立重组人干扰素β1b(IFN β1b)中氧化型干扰素(ox-IFN β1b)的测定方法。方法:RP-HPLC色谱条件:RP-C8色谱柱(Grace Vydac,4.6 mm×250 mm,5μm),柱温40℃,0.1%TFA-10%乙腈-水溶液为流动相A,0.1%TFA-乙腈溶液为流动相B,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长214 nm。结果:ox-IFN β1b峰与峰3的分离度约为4.0,理论塔板数大于20 000;6次进样的RSD小于5.0%;2个厂家共6批IFN β1b原液中均检出ox-IFN β1b,用面积归一化法计算百分含量为0.47%～0.96%。结论:新建方法可有效分离和测定不同厂家IFN β1b原液中的ox-IFN β1b,对IFN β1b质量标准的提高具有重要意义。

重组人干扰素β1b治疗复发缓解型多发性硬化症的安全性及临床疗效

目的观察重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)治疗复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的安全性及临床疗效。方法选择20名健康志愿者,分为1.5、3、6和9MIU4个剂量组,每天按剂量皮下注射1次rhIFNβ1b,连续注射8d,观察药物的安全性、耐受性和药代动力学。选择101例RRMS患者,随机分为观察组(52例)和对照组(49例),每周3次分别注射6MIU的rhIFNβ1b和25mg人血白蛋白,用药1年后,2组均注射6MIU的rhIFNβ1b,每周3次,用药1年。定期随访并进行各项指标及核磁共振成像(MRI)检查,观察药物的临床疗效,同时进一步观察安全性。结果安全性观察显示,rhIFNβ1b在9MIU剂量范围内耐受性良好。观察组和对照组分别注射rhIFNβ1b后,可显著减少RRMS患者头部与脊髓中病灶数量或缩小病灶体积,并显著降低复发率,且随着用药时间的延长,效果更加明显。结论rhIFNβ1b安全性和耐受性良好,临床影象学评价疗效显著。

反相高效液相色谱法测定注射用重组人干扰素β1b中干扰素β1b的含量

目的建立测定注射用重组人干扰素β1b（recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b）成品中干扰素β1b（interferonβ1b,IFNβ1b）含量的反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography,RPHPLC）。方法采用色谱柱ZORBAX 300SB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）,以含95%水、5%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相A液,以含5%水、95%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相B液,流速为1.5 ml/min,梯度洗脱10 min（A液从70%~30%）,检测波长为214 nm,柱温为35℃,进样量为20μl。对该方法的适用性、线性、精密度、重复性和准确度进行验证。用建立的方法检测3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。结果建立的方法系统适应性良好;IFNβ1b在20~100μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系,r2=0.998;供试品溶液连续6次进样,峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.97%;6份同一批供试品IFNβ1b含量的平均值为302.83μg/ml,RSD为0.99%;40、60和80μg/ml的IFNβ1b加标平均回收率分别为93.1%、94.18%和93.67%,RSD均〈2%。3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量分别为389.8、364.5和304.6μg/ml。结论建立的RP-HPLC法操作简便,精密度、重复性、准确度好,可用于测定注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。

注射用重组人干扰素β1b规模化分离纯化工艺的建立及其产品质量的检定

目的建立注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)规模化纯化工艺,并对该工艺制备产品的质量进行检定。方法采用高压均质机对rh IFNβ1b/BL21菌体进行破碎,离心提取包涵体,经有机抽提及酸化沉淀获得粗制rhIFNβ1b;通过Sephacryl S-200和Sephadex G-25层析纯化获得rhIFNβ1b原液,连续生产3批。将原液稀释,加入保护剂,经分装、冻干制备成品。同时对原液及成品的质量进行检定。结果 3批rhIFNβ1b原液蛋白产量可达6~7 g,平均回收率可达15.1%,平均效价为1.1×10~7 IU/mg,HPLC纯度和SDS-PAGE纯度均超过97%,一级序列和二级结构具有良好的一致性。每批rhIFNβ1b原液可制备出20 000~30 000支成品,且各项检定项目均合格。结论建立了rhIFNβ1b规模化分离纯化工艺,制品的产量、纯度及活性均较高,符合rhIFNβ1b工业化生产的要求。

MRI定量分析及其在多发性硬化研究中的应用(附5例MS患者MRI造影病灶初步分析)

目的 开展利用MRI增强病灶的定量分析及其对多发性硬化 (MS)治疗前后病情变化的对比研究 ,并观察干扰素 (interferon ,IFN) β1a的疗效。 方法 收集确诊的MS患者 5例 ,治疗前、后各观察 3个月 ,每月做MRI增强造影检查 1次 ,即治疗前后各查MRI 15例次。由专人进行病灶定量处理及治疗前、后对照处理。结果 治疗前、后GD增强病灶阳性例次分别为 10和 7例次 ,总病灶数为 12 1和 38(平均每例次分别为 8 1和2 5)个 (P =0 0 36) ,病灶面积为 34 0 9 4和 142 8 9(平均 2 2 7 3和 95 3)mm2 (P =0 0 69)。结论 MRI定量分析对判定MS病情变化和临床疗效有实用价值 ,IFN

新型口服多发性硬化病治疗药物芬戈莫特

作为最新获准上市的一个多发性硬化病治疗药物,芬戈莫特不仅具有新型的作用机制——属1磷酸鞘氨醇受体调节剂,且是迄今全球范围内获准治疗复发缓解型多发性硬化病的第一个口服药物。Ⅲ期安慰剂对照临床试验证实,芬戈莫特治疗复发缓解型多发性硬化病患者在降低复发风险、减少新或扩大了的损害数、延长至再次复发时间和延缓病残进展方面的疗效都显著优于安慰剂。与复发缓解型多发性硬化病标准治疗药物β1a干扰素进行直接比较的Ⅲ期临床研究还显示,芬戈莫特治疗降低复发率、延长至再次复发时间和减少新或扩大了的损害数的疗效也显著更优,而总副反应发生率却与β1a干扰素相似。芬戈莫特为一日1次用药,用药时不需考虑进食及进食时间的影响,药物药物和药物食物相互作用潜力均很低。芬戈莫特口服治疗复发缓解型多发性硬化病患者安全、有效,同时用药方案亦十分简便,日后极可能成为复发缓解型多发性硬化病治疗的首选一线用药。

养阴活血汤早期干预对大鼠肺间质纤维化的影响

目的观察养阴活血汤对博莱霉紊诱导的大鼠肺间质纤维化疗效以及对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA表达的影响。方法96只雌性Wistar大鼠，随机分为正常组、模型组、中药组和干扰索β1a（interferon-β1a，IFN-β1a）组。气管内注入博莱霉素A2建立大鼠肺间质纤维化模型。中药组自造模次日始，每只大鼠灌胃浓缩中药每天20ml／kg，IFN-β1a组皮下注射重组人IFN-β1a4．6μg／kg，每周3次。正常组和模型组等体积生理盐水灌胃。各组大鼠在实验周期第3天、第7天、第14天和第28天腹主动脉放血法处死，进行肺系数检测，HE和VG染色，原位杂交测定大鼠肺组织中TGF-β1和CTGF的mRNA表达情况。结果养阴活血汤能明显降低肺系数，使肺组织的病理改变减轻，可以减弱大鼠肺组织和原代培养肺成纤维细胞中TGF-β1mRNA和CTGFmRNA的表达强度。结论养阴活血汤可以减少TGF-β1mRNA和CTGFmRNA的表达量，减弱细胞因子对肺间质纤维化的促进作用，从而起到抑制肺问质纤维化的作用。