重组人干扰素λ1的表达、纯化及生物活性研究

目的:利用大肠杆菌系统表达重组人Ⅲ型干扰素λ1(rhIFN-λ1),并进行纯化,以比较其与重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)生物学活性的差异。方法:密码子优化的rhIFN-λ1基因与pET-44a载体连接构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经系列层析纯化;采用细胞病变抑制法比较纯化的rhIFN-λ1与rhIFN-α2b、市售rhIFN-λ1的抗病毒活性;采用MTS法比较这些干扰素的抗肿瘤细胞增殖活性。结果:基因优化后的rhIFN-λ1在大肠杆菌中得以高效表达,用所建立的纯化工艺可制备得到纯度达95.7%的rhIFN-λ1;rhIFN-λ1的抗病毒比活性为3.2×105 U/mg,比市售rhIFN-λ1的比活性(1.1×105 U/mg)略高,抗肿瘤细胞增殖活性为rhIFN-α2b的1.7倍。结论:获得的rhIFN-λ1具有剂量依赖的抗病毒活性和抗增殖活性,其抗病毒活性比市售rhIFN-λ1略高,抗细胞增殖活性高于rhIFN-α2b,提示rhIFN-λ1有较大的应用前景。

人干扰素λ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及其转录活性分析

目的构建人干扰素λ1(interferonλ1,IFNλ1)基因启动子荧光素酶报告基因载体,并探讨仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7对其转录活性的影响。方法提取BEAS-2B细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增IFNλ1基因启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-enhancer,构建IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,将其转染293T细胞,同时用质粒IFNβ-luc和pGL3-enhancer转染作为对照。转染24 h后感染仙台病毒,于感染前和感染后4、12、18和24 h收集细胞,进行双荧光素酶活性检测;用质粒IRF3-5D或HA-IRF7与质粒IFNL1-luc共转染,36 h后收集细胞,进行双荧光素酶活性检测。结果 IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;分别转染质粒IFNL1-luc和IFNβ-luc的细胞感染仙台病毒后,荧光素酶活性倍数均随时间延长呈明显上升趋势,至18 h达到峰值(分别为1 000倍和2 300倍),转染质粒pGL3-enhancer的细胞感染仙台病毒后,不同时间点收集的细胞,荧光素酶活性倍数一直处于较低水平;质粒HA-IRF7或IRF3-5D对IFNL1-luc的活化倍数明显高于pGL3-enhancer(P<0.05)。结论成功构建了IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7均能激活IFNL1-luc的转录,为进一步研究调控IFNλ1表达的信号转导通路奠定了基础。

干扰素-λ1在人类鼻病毒感染后儿童呼吸道上皮细胞中的表达

目的研究人类鼻病毒(HRV)感染后儿童呼吸道上皮细胞中干扰素(IFN)-λ1的表达水平。方法收集2017年2~10月因急性呼吸道感染住院的患儿痰液及鼻咽拭子标本,分别进行细菌培养及11种呼吸道病原体核酸检测,筛检出单纯HRV阳性患儿90例作为HRV感染组,单纯呼吸道合胞病毒(RSV)阳性患儿95例为RSV感染组。另选取同期门诊体检且病原检测结果均阴性的健康儿童50例为健康对照组。采集各组儿童鼻咽拭子标本,采用荧光定量PCR检测病毒载量和IFN-λ1 mRNA表达水平。结果在HRV感染组,IFN-λ1m RNA的表达水平在不同性别及不同年龄组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。HRV感染组IFN-λ1 mRNA的表达水平与HRV的病毒载量无相关性(P>0.05)。HRV感染组的IFN-λ1 mRNA表达水平高于健康对照组,但低于RSV感染组(P<0.05)。结论 HRV可诱导呼吸道上皮细胞中IFN-λ1的表达;推测IFN-λ1在机体抗HRV感染中可能起到重要作用。

系统性红斑狼疮患者血清λ1干扰素的测定及临床意义

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中λ1干扰素(IFN-λ1)的水平,探讨其水平与SLE其他指标的关系及其在SLE发病中的作用。方法采用ELISA法检测60例SLE患者和20名正常对照者血清IFN-λ1水平,统计分析其与SLE活动指数(SLEDAI)及其他实验室指标的相关性。结果SLE患者血清IFN-λ1水平为(74.2±16.1)pg/ml,其中病情活动组为(75.1±17.3)pg/ml,病情非活动组为(72.5±17.3)pg/ml,均高于正常对照组(70.4±12.6)pg/ml,但差异无统计学意义,且病情活动组高于病情非活动组,差异也无统计学意义。SLE患者中白细胞减少组血清IFN-λ1水平为(80.1±18.1)pg/ml,高于正常对照组,但差异无统计学意义(P=0.052),同时也高于SLE患者中白细胞正常组(70.6±13.7)pg/ml,差异有统计学意义(P=0.024)。血清IFN-λ1与SLEDAI、C3、C4、24h尿蛋白定量等临床指标不相关。结论IFN-λ1可能参与SLE白细胞减少的过程,本研究未证实IFN-λ1水平与疾病活动相关。

重组人干扰素λ1在HEK-293F细胞中的表达及鉴定

目的 采用HEK-293F细胞瞬时转染表达重组人干扰素λ1(recombinant human interferonλ1,rhIFNλ1),并进行鉴定。方法 通过2种信号肽[T细胞受体(T cell receptor,TCR)和天然信号肽(nature signal peptide,NSP)]、3种载体[pcDNA3.4、泛染色质开放原件(ubiquitous chromatin opening element,UCOE)、PFR]和目的基因rhIFNλ1构建6种信号肽-载体组合的重组质粒,以HEK-293F为宿主细胞,摇瓶规模瞬时转染表达rhIFNλ1。选择NSP及载体UCOE构建低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ,瞬时转染HEK-293F细胞,表达产物经阳离子交换层析(HiTrap SP FF)、蓝胶层析(HiTrap Blue HP)和分子筛凝胶过滤层析(Sephacryl S-100 HR)3步纯化,纯化产物进行Western blot及反相HPLC分析,并检测质谱分子量及N-末端氨基酸序列。结果 6种重组质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。随着转染时间的延长,6种表达产物的表达量逐渐增加,转染6 d时最高,达10~20 mg/L。低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组质粒UCOE-Q46-λ转染HEK-293F细胞6 d,细胞培养上清纯化产物的相对分子质量约27 800,纯度达97.372%,且可与小鼠抗人IL-29/IFNλ1单克隆抗体发生特异性结合;反相HPLC检测分析可见2个峰,出峰时间分别为15.6和20.0 min;质谱分子量约为24 000;N-末端5个氨基酸序列为G-P-V-P-T。结论 HEK-293F细胞表达的rhIFNλ1纯度较高,为该蛋白的进一步研究奠定了基础。

hIFN-λ1(hIL-29)基因及在COS-7细胞中瞬时表达和抗病毒效应

目的:克隆hIFN-λ1基因,构建pcDNA3.1A-IFN-λ1表达质粒,并在真核细胞中获得表达,以进一步研究rhIFN-λ1的生物学特性。方法:采用RT-PCR法从病毒诱导的A549细胞mRNA中克隆hIFN-λ1基因,并重组于pcDNA3.1A真核表达载体上。结果:经双酶切和PCR鉴定及DNA序列分析,发现所克隆的基因与GenBank公布的序列一致,并在COS-7细胞中获得了有效瞬时表达。结论:成功克隆了hIFN-λ1基因,并成功地获得了瞬时表达,其rhIFN-λ1表达产物具有抗病毒活性。

RSV感染患儿呼吸道上皮细胞中干扰素-λ1的表达水平及其与RSV载量的关系

目的了解呼吸道合胞病毒(RSV)感染患儿呼吸道上皮细胞中干扰素(IFN)-λ1的表达水平及其与RSV载量的关系。方法收集2015年6月至2016年6月期间因呼吸道感染住院患儿的鼻咽拭子标本,采用直接免疫荧光法行7种常见呼吸道病毒(含RSV)抗原检测,筛选出单纯RSV阳性患儿作为RSV感染组(n=120);另收集同期门诊体检健康儿童鼻咽拭子标本,行7种常见呼吸道病毒检查均为阴性的儿童作为健康对照组(n=50)。对两组儿童鼻咽拭子标本行荧光定量PCR检测RSV载量和IFN-λ1 m RNA水平。结果 RSV感染组鼻咽拭子中IFN-λ1 m RNA水平显著高于健康对照组(P<0.05),且IFN-λ1 m RNA水平与RSV载量呈正相关(r=0.56,P<0.05)。结论 RSV可诱导呼吸道上皮细胞中IFN-λ1的表达,推测IFN-λ1在机体抗RSV感染中可能起重要作用。

流感病毒感染后儿童呼吸道上皮细胞中干扰素-λ1表达水平的临床研究

目的:探讨儿童呼吸道上皮细胞中的干扰素λ1(IFN-λ1)在流感病毒(IFV)感染后的表达变化.方法:回顾分析了2017年10月~2019年1月在湖南省人民医院儿童中心住院的急性呼吸道感染性疾病的儿童鼻咽拭子标本,进行了11种儿童常见呼吸道病原核酸的检测,筛选出了100例A型流感病毒(IFVA)感染组(仅IFVA阳性),99例B型流感病毒(IFVB)感染组(仅IFVB阳性),92例呼吸道合胞病毒(RSV)感染组(仅RSV阳性),90例人鼻病毒(HRV)感染组(仅HRV阳性)儿童,56例健康体检儿童作为阴性对照组,均采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对鼻咽拭子标本的IFN-λ1表达及病毒拷贝量进行检测.结果:在IFVA及IFVB感染组不同年龄组间IFN-λ1表达量无差异.IFVA及IFVB感染组IFN-λ1表达量分别较对照组升高,且均较RSV感染组及HRV感染组升高.IFN-λ1表达量在IFVA及IFVB感染组分别与其病毒拷贝量无明显相关,但与流感病毒感染后的临床评分存在正相关.结论:IFN-λ1可经IFV诱导在呼吸道上皮细胞表达,且与IFV感染儿童的疾病严重程度相关,推测IFN-λ1参与了机体抗IFV过程.

腺病毒肺炎患儿干扰素-λ1表达水平与腺病毒载量的关系

目的:研究人腺病毒(human adenovirus,HAdV)感染后呼吸道上皮细胞中的λ1干扰素(interferon-λ1,IFN-λ1)的表达情况。方法:选取2019年1―12月因腺病毒肺炎住院的143例患儿为HAdV组,另选取同期35例呼吸道病原结果均阴性者作对照组,采集鼻咽拭子提取核酸,用荧光定量PCR检测病毒载量、IFN-λ1 mRNA表达水平和HAdV测序分型。结果:HAdV组、HAdV组中不同年龄段、单纯感染组、混合感染组、重症组、非重症组、HAdV-3组、HAdV-7组IFN-λ1 mRNA的表达水平均低于对照组。重症组HAdV载量高于非重症组;HAdV组、重症组、HAdV-7组的IFN-λ1 mRNA的表达水平与病毒载量有相关性。结论:儿童腺病毒肺炎病情严重程度与病毒载量相关,其IFN-λ1表达水平降低,提示IFN-λ1可能参与了腺病毒感染的疾病进程。

N-糖基化位点突变的人IFN-λ1在毕赤酵母中的表达、纯化及表征(英文)

IFN-λ1是Ⅲ型干扰素家族的一个成员,具有与Ⅰ型干扰素相似的功能。此前,我们已经从毕赤酵母表达获得了可溶性重组人干扰素-λ1。然而,毕赤酵母表达中的高糖基化带来了免疫原性,影响了蛋白质的生产纯化效率。为了克服这个缺点,文中构建了一种干扰素突变体(rhIFN-λ1-Nm),定点突变潜在糖基化位点。AOX1启动子与α因子信号序列存在的情况下,用甲醇诱导成功地实现了rhIFN-λ1-Nm在毕赤酵母GS115胞外分泌表达。对rhIFN-λ1-Nm进行纯化,获得了纯度>98%的产品,并对糖化水平、分子量、二级结构、N末端序列等理化性质和生物活性进行了研究。研究结果表明,rhIFN-λ1-Nm糖基化水平明显降低,蛋白质生产纯化收率显著提高,而对结构和生物活性无影响;糖基化位点突变rhIFN-λ1可以被开发为IFN-λ1的替代品,有望发展成为未来的生物免疫制剂。