γ-干扰素基因pIRES改进型黄色荧光蛋白载体的构建

【目的】构建携带γ 干扰素基因 (ifn γ)的pIRES改进型黄色荧光蛋白载体 (pIRES EYFPIFN γ) ,为γ 干扰素基因的体内外表达及蛋白定位提供理想的标记。【方法】根据已知γ 干扰素基因序列 ,设计在目的片段两端分别带EcoRⅤ和NotⅠ酶切位点序列的 2条引物 ,用PCR技术从质粒 pcDNA3IFN γ中扩增出ifn γ(499bp) ,PCR产物用 EcoRⅤ和 NotⅠ双酶切后回收纯化 ,定向克隆至商品质粒 pIRES EYFP ,重组质粒 pIRES EYFPIFN γ用限制性内切酶酶切和DNA序列分析鉴定。同时以脂质体为介导 ,将 pIRES EYFPIFN γ转染正常人眼Tenon囊成纤维细胞 ,4 8h后于荧光倒置显微镜下观察基因的表达。【结果】DNA序列分析证明PCR产物为ifn γ ,将重组质粒转染正常人眼Tenon囊成纤维细胞 ,荧光倒置显微镜下可见黄色荧光蛋白的表达 ,转染率约为 4 3%。【结论】成功构建 pIRES EYFPIFN γ载体为利用黄色荧光蛋白标记在体内外进行γ

人γ-干扰素基因修饰的结肠癌细胞株的建立

目的建立人γ-干扰素(IFN-γ)基因修饰的结肠癌细胞株.方法用逆转录病毒质粒pL(IFN-γ)SN将人IFN-γ基因转导入人结肠癌细胞株Lovo中,用G418进行筛选.结果筛选得到抗性克隆Lovo/IFN-γ,能在0.6 g.L^(-1)G418中稳定生长;Lovo/IFN-γ生长曲线与野生型Lovo无异;RT-PCR证实IFN-γ基因在Lovo/IFN-γ中表达;Lovo/IFN-γ能分泌人IFN-γ,细胞内水平为3.0fg.d^(-1).结论成功建立了人IFN-γ基因修饰的结肠癌细胞株,为进一步研究奠定了基础.

人肺癌细胞γ-干扰素基因的转染及特性分析

目的 :建立转基因 A5 49细胞株 ,从特性上进行分析 ,探讨其作为抗肿瘤瘤苗的可能性。方法 :将 p L XSN质粒与人 IFN-γ基因体外重组 ,转染入人肺腺癌细胞株 A5 49中 ,经筛选获得稳定表达γ-干扰素的 A5 49- IFN-γ细胞株 ,对其生长特性、细胞表面 MHC分子表达变化、IFN-γ的分泌量及致瘤性等方面进行了探讨。结果 :转基因细胞株与原细胞株相比较 ,生长状态没有明显的变化 ,转基因细胞株可稳定表达并向细胞外分泌γ-干扰素 ;而且其细胞表面 MHC- 和 MHC- 分子表达明显增加 ,提示其免疫原性增强 ;裸鼠实验表明其致瘤性下降。结论 :该转基因细胞株有可能成为治疗肺癌的转基因瘤苗。

γ-干扰素释放试验对艾滋病并发结核感染的诊断价值

目的:探讨γ-干扰素释放试验(IGRA)在艾滋病病毒(HIV)阳性患者中结核(TB)的诊断价值。方法:选择HIV阳性无活动性结核组92例、HIV阳性并发活动性结核42例、HIV阴性结核阳性18例,用γ-干扰素释放试验试剂A.TB、结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂QFT和结核菌素试验TST对所有患者进行结核感染检测,分析三种方法在HIV并发结核感染患者中结核检测的优劣。结果:A.TB阳性87例(57.2%),QFT阳性78例(51.3%),TST阳性59例(38.3%)。在HIV+组中,A.TB阳性率46.7%,QFT阳性率41.3%,TST阳性率32.6%。在HIV+/TB+组中A.TB阳性率为69.0%,QFT阳性率为61.9%,TST阳性率为38.1%;在HIV-/TB+组中,A.TB阳性率为83.3%,QFT阳性率为77.8%,TST阳性率为72.2%。这两种IGRA检测试剂有很强的相关性为81.1%,但是QFT的检测结果受到低CD_4^+细胞数量的影响,而A.TB不受CD_4^+细胞数量的影响。结论:A.TB的检测结果在HIV患者中不受低CD_4^+细胞数量的影响,A.TB将是HIV感染者进行结核检测的一个有效手段。

IFN-γ基因+874位点单核苷酸多态性与乙型肝炎病毒感染关系的研究

【目的】研究干扰素(IFN-γ)基因+874位点单核苷酸多态性与乙型肝炎病毒(HBV)感染、转归的关系,探讨HBV感染的遗传易感因素。【方法】采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)技术检测231例慢性HBV感染者、165例自限性HBV感染者和135名正常对照者IFN-γ基因第一内含子+874位点T/A单核苷酸多态性。【结果】慢性HBV感染组IFN-γ基因+874位点AA基因型频率(78.8%)显著高于正常对照组(64.4%)(χ2=9.60,P=0.008),而自限性HBV感染组(62.4%)和对照组之间差异无显著性(χ2=0.16,P=0.92)。进一步比较慢性HBV感染者IFN-γ基因+874位点单核苷酸多态性与HBV-DNA复制的关系,发现IFN-γ基因+874位点基因型和等位基因频率在低水平HBV-DNA组和高水平HBV-DNA组之间的分布差异无显著性。【结论】IFN-γ基因第一内含子+874位点多态性与慢性HBV感染有关,提示该位点多态性可能在决定个体HBV感染遗传易感性方面有一定意义。

IL-17、IFN-γ在内毒素诱导性葡萄膜炎大鼠模型中的表达及其意义

【目的】探讨白介素-17（IL-17）mRNA及干扰素-7（IFN-7）mRNA在内毒素诱导性葡萄膜炎大鼠模型中的表达及其意义。【方法】将40只SD大鼠分为空白对照组（n=10）与模型组（n=30），模型组均采用内毒素诱导葡萄膜炎大鼠模型，并在注药6h、12h、18h、24h、48h、60h分别处死5只大鼠，对照组注射磷酸缓冲盐溶液（PBS）24h后处死10只，均取双眼葡萄膜视网膜组织，采用反转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测两组眼部组织IL-17mRNA及IFNj7mRNA水平，显微镜下观察眼部组织炎症情况并按相关标准予以评分。【结果】①模型组造模不同时间眼部炎症评分均高于空白对照组（P〈O．05），模型组造模6h、12h、18h后炎症评分依次升高（Pd0．05），18h到达峰值，然后24h、48h、60h依次降低（Pd0．05）；②模型组造模不同时间IL17mRNA、IFN-7mRNA水平均高于空白对照组（P〈0．051），模型组造模6h、12h、18h后IL-17mRNA、IFN-ymRNA水平依次升高（Pd0．05），18h到达峰值，然后24h、48h、60h依次降低（P〈O．05）。【结论】葡萄膜炎大鼠眼部组织中IL-17mRNA、IFN-ymRNA表达水平上调，与病变程度呈一致，IL-17、IFN．7均可能参与葡萄膜炎的发病过程。

小鼠内皮抑素基因克隆、测序及pEgr-IFNγ-mEndostatin重组双基因表达质粒的构建

目的 :克隆小鼠内皮抑素 (m Endostatin)编码区 c DNA序列并构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和 m Endo-statin双基因表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应法 (RT- PCR) ,以小鼠肝细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m Endostatin,与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和m Endostatin双基因表达质粒。结果 :经测序证实获得的 m Endostatin序列与文献报道完全一致 ,并构建了含 Egr-1启动子的 IFNγ和 m Endostatin双基因表达质粒 p Egr- IFNγ- m Endostatin。结论 :利用 RT- PCR法成功克隆了m Endostatin的 c DNA序列 ,构建了 p Egr- IFNγ- m Endostatin重组双基因表达质粒。

过敏性疾病患者血清Th1/Th2细胞因子和趋化因子测定及其意义

目的:检测过敏性疾病患者血清Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-13以及趋化因子Eotaxin、RANTES、LTB4的水平,探讨其临床意义。方法:过敏性疾病患者64例,正常对照21例。采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、LTB4、RANTES和Eotaxin水平。结果:1过敏性疾病患者血清IL-4、IL-5、IL-13和Eotaxin、LTB4水平较对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。2IFN-γ和RANTES在过敏性疾病患者血清中的水平低于对照组,但无统计学差异(P>0.05)。3IL-4、IL-5、IL-13和LTB4彼此之间呈显著正相关(P<0.01)。4Eotaxin、RANTES和IFN-γ彼此之间呈显著正相关(P<0.05)。5LTB4和Eotaxin之间呈显著正相关(P<0.01)。结论:过敏性疾病的发生存在多种细胞因子和趋化因子复杂的相互作用。

铁调素、IFN-γ,TNF-α负调控因子对肿瘤性贫血患者红系增生的影响

【目的】探讨铁调素（hepcidin，Hepc）、干扰素-γ（interferon-γ，INF-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF—α）等调控因子对肿瘤性贫血（cancer relate anemia，CRA）患者红系增生的影响。【方法】检测CRA患者53例（肿瘤贫血组）、肿瘤非贫血患者67例（肿瘤非贫血组）和50例健康者（对照组）白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、红细胞平均体积（MCV）、血红蛋白（Hb）、网织红细胞（RET），采用酶联免疫吸附试验检测促红细胞生成素（Erythropoietin，EP0）、铁蛋白（serum ferritin，SF）、TNF—α、INF-γ、Hepc水平；并分析各因子的相关性。【结果】肿瘤贫血组WBC、RBC、MCV、Hb显著低于肿瘤非贫血组和对照组，RET显著高于肿瘤非贫血组和对照组（P〈0．05）；肿瘤贫血组EPO、TNF-α、INF-γ水平均显著高于肿瘤非贫血组和对照纽（P〈0．05），肿瘤非贫血组EPO又显著高于对照组（P〈0．05）；贫血组SF、Hepc表达水平显著低于肿瘤非贫血组和对照组（P〈0．05）。相关性分析显示肿瘤性贫血患者血清TNF-α与Hepc、EPO呈负相关（P〈0．05），INF-γ与Hepc呈负相关（P〈0．05），Hepc与EPO呈负相关（P〈0．05）。【结论】Hepc、TNF-α、INF-γ等负调控因子作用于EPO，导致骨髓红系对EPO的反应性相对偏低，可能是CRA的发病机制之一。

IFN-γ与HIV-1gp120融合蛋白的表达及其免疫调节作用

目的:研究gamm a干扰素(IFN-γ)对人类免疫缺陷病毒(H IV-1)gp120蛋白免疫小鼠后效果的调节作用。方法:利用分子生物学技术,构建表达中国流行株H IV-1gp 120 N端片段基因的原核质粒p et44b-gp 120,及共表达H IV-1gp 120 N端片段基因与IFN-γ基因的原核质粒p et44b-gp 120/IFN-γ,在E.coli BL 21(DE 3)细胞中进行低温诱导蛋白表达,然后经纯化后免疫BALB/c小鼠。实验设皮下注射gp120/IFN-γ组、gp120组和PBS三组,以检测H IV-1gp120诱导的T细胞增殖能力,CTL杀伤作用以及Th1型细胞因子(IL-2,IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4,IL-10)的表达情况。结果:通过PAGE和W estern b lot检测,证实上述两种蛋白在DE 3细胞中得到表达。免疫学实验表明,针对H IV-1 gp120的特异性T淋巴细胞增殖作用、特异性CTL杀伤作用,以及Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ表达在三组之间均有显著性差异(P<0.05),gp120/IFN-γ组高于gp120组,gp120组高于PBS组(P<0.05)。反映体液免疫反应的Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达在三组之间没有显著性差异(P>0.05)。结论:协同应用IFN-γ基因可明显加强H IV-1gp 120基因的细胞免疫反应。

早期梅毒外周血CD4＋T细胞白介素-4、干扰素-γ表达及调控区域甲基化状态研究

目的 研究早期梅毒患者外周血T淋巴细胞白介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）mRNA的表达及其基因调节序列甲基化状态.方法 免疫磁珠法（MACS）分离10例Ⅰ期梅毒、10例Ⅱ期梅毒患者和10例正常人外周血CD4＋T细胞,实时荧光定量PCR （RT-PCR）检测IFN-γ 、IL-4基因mRNA的表达,甲基化特异性PCR（MSP）检测IFN-γy、IL-4基因调节序列的甲基化状态并进行比较.结果 与Ⅱ期梅毒患者及正常对照组比较,IFN-γ基因mRNA表达在Ⅰ期梅毒患者中明显升高（P＜0.01）,与正常对照组及Ⅰ期梅毒患者比较,IL-4基因mRNA表达在Ⅱ期梅毒患者中明显增高（P＜0.01）.与Ⅱ期梅毒组及对照组比较,Ⅰ期梅毒组IFN-γ基因的位点甲基化水平、甲基化指数差异均有统计学意义（t=6.32,t=8.99,P＜0.01;t=26.63,t=25.53,P＜0.01）.与Ⅰ期梅毒组及对照组比较,在Ⅱ期梅毒组中IL-4基因的位点甲基化水平差异有统计学意义（t=29.83,t=33.78,P＜0.01）,但甲基化指数无明显变化（P＞0.05）.结论 早期梅毒患者中细胞因子IFN-γ、IL-4的异常表达与其相关调控区域的甲基化状态异常有关.

原位杂交方法检测IFN-γ在胃癌中的表达

目的 :研究干扰素 -γ(IFN γ)在胃癌中的表达规律及可能的意义。方法 :应用分子克隆方法 ,克隆IFN γ基因片断 ,并通过体外转录方法制备寡核苷酸探针。在石蜡包埋的 5 8例胃癌组织和 5 3例癌旁正常组织中 ,采用原位杂交方法检测IFN γmRNA的表达。结果 :癌旁组织中胃上皮细胞IFN γ阳性率为 4 9 1% ,而胃癌组织中未发现 1例阳性 ,两组间差异有极显著意义 ,χ2 =37 15 6 ,P =0 0 0 0。结论 :胃癌细胞不表达IFN γ ,可能与胃上皮细胞癌变及免疫逃逸有关。

子宫内膜异位症治疗前后CD19＋CD5＋B细胞变化的研究

目的研究子宫内膜异位症患者治疗前、后CD19＋CD5＋B细胞数量及分泌细胞因子的变化，为临床治疗提供实验依据。方法对本院35例子宫内膜异位症患者（实验组），29例子宫肌瘤患者（对照组）行流式细胞术、Q—PCR检测患者外周血、腹腔冲洗液及子宫内膜组织中CD19＋CD5＋B细胞的数量及分泌细胞因子的检测，比较治疗前、后子宫内膜异位症患者外周血中CD19＋CD5＋B细胞数量以及分泌细胞因子的变化。结果子宫内膜异位症患者外周血、腹腔冲洗液及异位子宫内膜组织中CD19＋CD5＋B细胞的比例高于对照组[（13．1±1．9）％、（12．1±2．0）％、（11．7±1．7）％vs（2．9±0．8）％、（2．6±0．9）％、（2．8±1．1）％，P〈0．01]，CD19＋CD5＋B细胞的IFN-1mRNA的表达水平高于对照组[（7．2±1．0）×10^3、（7．9±1．3）×10^3、（7．4±1．1）×10^3拷贝vs（1．9±0．7）×10^3、（2．2±0．8）×10^3、（2．0±0．5）×10^3拷贝]，IL-10mRNA表达水平高于对照组[（6．4±0．9）×10^3、（6．8±1．2）×10^3、（6．1±0．8）×10^3拷贝vs（1．7±0．5）×10^3、（2．1±0．9）×10^3、（1．6±0．4）×10^3拷贝，P〈0．01]。治疗后，子宫内膜异位症患者外周血中CD19＋CD5＋B细胞数量低于治疗前[（13．1±1．9）％vs（7．3±1．2）％，t=16．12，P〈0．01]，仍高于对照组[（2．8＋-0．7）％，t=18．51，P〈0．01]，CD19＋CD5＋B细胞中的IFN-y mRNA的表达水平低于治疗前[（7．2±1．0）×10^3拷贝vs（3．3±0．6）×10^3拷贝，t=20．89，P〈0．01]，仍高于对照组[（2．4±0．5）×10^3拷贝，t=6．702，P〈0．01]，IL-10mRNA的表达水平低于治疗前[（6．4±0．9）×10^3拷贝vs（3．2±0．7）×10^3拷贝，t=17．53，P〈0．01]，仍高于对照组[（2．1±0．4）×10^3拷贝，t=7．79，P〈0．01]。结论子宫内膜异位症中CD19＋CD5＋B细胞数量的增加，通过高分泌IFN-γ、IL-10，其参与了疾病的发生。

血清IFN-γ、IL-18及IL-10与复发性流产的相关性研究

目的探讨血清中IFN-γ、IL-18及IL-10的水平与复发性流产（RSA）的关系。方法采用酶联免疫吸附法检测复发性流产患者40例（RSA组）及正常早孕妇女40例（对照组）血清IFN-γ、IL-18及IL-10的水平，2个月后随访，再次测定两组对象未孕状态时血清各细胞因子的水平。结果RSA组流产发生时血清IFN-γ、IL-18水平显著高于对照组（P〈0．01）；而IL-10水平显著低于对照组（P〈0．01）；两组患者终止妊娠2个月后，在未孕状态时血清IFN-γ、IL-10的水平差异无统计学意义（P〉0．05），而RSA组血清IL-18水平持续维持高水平状态。结论复发性流产患者血清IFN-γ、IL-18水平升高而IL-10水平降低，IFN-γ、IL-18及IL-10与复发性流产的关系密切。

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对哮喘大鼠气道炎症的影响

目的观察CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋Treg）对哮喘大鼠气道炎症的影响。方法将卵白蛋白（OVA）免疫耐受大鼠CD4^＋CD25^＋Treg细胞过继转移给哮喘大鼠，然后观察支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞计数及分类，ELISA检测BALF中IL-4、IL-5和IFN-1及血清OVA特异性IgE含量，HE染色观察肺组织的病理改变。结果与哮喘组比较，过继转移CD4^＋CD25^＋Treg细胞后哮喘大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分率降低（P〈0．05），嗜酸性粒细胞（Eos）百分率明显降低（P〈0．01）；BALF中IL4和IL-5含量明显降低，IFN-1含量明显升高，血清OVA特异性IgE含量明显降低（P〈0．05）；气道炎症明显减轻。结论过继转移OVA免疫耐受大鼠CD4^＋CD25^＋Treg细胞可以明显抑制哮喘的慢性气道炎症。

PBMCs结核分枝杆菌特异性抗原反应性MIG和IFN-γ对活动期肺结核的鉴别诊断意义

目的研究活动期肺结核和常见肺部鉴别诊断疾病肺炎及原发性肺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后干扰素-γ诱导的单核因子（Monokine induced by interferon gamma，MIG）和干扰素-γ（IFN-1）的表达特点及诊断意义。方法90例初治活动期肺结核患者，31例细菌性肺炎和原发性支气管肺癌患者，分离外周血PBMCs，用结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激，采用Flowcytomix流式技术检测细胞培养液上清上中MIG和IFN-γ的表达。用接受者工作特征曲线（ROCcurve）评价结核分枝杆菌特异性抗原反应性MIG和IFN-γ的诊断价值。结果PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后，培养液上清中MIG水平显著升高，初治活动期肺结核患者与其他肺病对照组差异有统计学意义（3023．0pg／mlvs112．5pg／ml，P〈0．0001），与IFN-γ的表达水平呈正相关（r=0．7168，P〈0．0001），单独应用MIG诊断肺结核的敏感性为94．4％，单独应用IFN-γ诊断肺结核的特异性为96．8％，二者并联应用诊断肺结核的敏感性为97．8％，特异性为87．1％。结论结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激外周血单个核细胞产生的MIG和IFN-γ能够良好的鉴别初治活动期肺结核及常见的细菌性肺炎和原发性支气管肺癌，可能成为新的诊断指标。

白塞病的细胞因子表达研究

目的通过检测白塞病患者外周血中IFN-γ、IL-12、IL-6的表达，探讨细胞因子与白塞病发病的关系。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测40例白塞病患者和40例健康志愿者外周血IFN-γ、IL-12、IL-6的表达。结果白塞病组中血清IFN-γ、IL-12及IL-6水平均高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）；其中IFN-γ、IL-12血清水平在白塞病活动纽与缓解组之间差异无统计学意义（P〉0．05），而血清IL-6水平在活动组与缓解组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。白塞病纽与对照组之间IL-6／IL-12比值比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论患者Th1型与Th2型免疫反应均增强，但存在Th2细胞优势活化状态，破坏了体内Th1／Th2的平衡，可能与白塞病发病及病情活动有关。

慢性牙周炎和慢性牙周炎合并慢性阻塞性肺疾病患者血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α的检测及临床意义

目的探讨慢性牙周炎和慢性牙周炎合并慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者血清白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素-γ（IFN-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）的表达水平及临床意义。方法收集2015年8月至2016年8月朝阳医院31例慢性牙周炎合并COPD患者设为A组、31例慢性牙周炎患者设为B组，另收集同期31例单纯COPD患者设为对照组。抽取各组患者空腹静脉血4ml，以细胞因子微球检测技术（CBA）测定血清炎性因子指标（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α）水平，并统计对比各组牙周情况[菌斑指数（PLI）、临床附着丧失（CAL）、探诊深度（PD）、出血指数（BI）]及肺功能指标[第1秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV．％）、第1秒用力呼气容积占用力肺活量百分比（FEV1／FVC）]。结果B组PLI、CAL、PD、BI大于对照组，A组各指标大于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。B组FEV1％、FEV1／FVC与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05），A组各指标小于B组、对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。B组血清IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF—α水平高于对照组，A组各指标水平高于B组；B组血清IL-2、IL-10水平低于对照组，A组各指标水平低于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论慢性牙周炎及慢性牙周炎合并COPD患者牙周状况及肺功能状况不佳，血清IL4、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平增高及IL-2、IL-10水平降低可能为慢性牙周炎及COPD发病和进展的重要危险因素，可通过检测上述指标水平调整治疗方案。